Ekstrakcja żelu

W biologii molekularnej ekstrakcja żelowa lub izolacja żelowa to technika stosowana do izolowania pożądanego fragmentu nienaruszonego DNA z żelu agarozowego po elektroforezie w żelu agarozowym . Po ekstrakcji interesujące fragmenty można zmieszać, wytrącić i zligować enzymatycznie w kilku prostych krokach. Proces ten, zwykle wykonywany na plazmidach , jest podstawą elementarnej inżynierii genetycznej .

Po przeprowadzeniu analizy próbek DNA na żelu agarozowym ekstrakcja obejmuje cztery podstawowe etapy: identyfikację interesujących fragmentów, wyizolowanie odpowiednich prążków, wyizolowanie DNA z tych prążków oraz usunięcie towarzyszących soli i plam.

Na początek na żel naświetla się promieniowaniem UV , aby oświetlić całe DNA wybarwione bromkiem etydyny . Należy zachować ostrożność, aby uniknąć narażenia DNA na promieniowanie mutagenne dłużej niż jest to absolutnie konieczne. Żądany pasek jest identyfikowany i fizycznie usuwany za pomocą szkiełka nakrywkowego lub żyletki . Usunięty plaster żelu powinien zawierać w sobie pożądane DNA. Alternatywna metoda, wykorzystująca barwienie żelem SYBR Safe DNA i naświetlanie światłem niebieskim, pozwala uniknąć uszkodzeń DNA związanych z bromkiem etydyny i promieniowaniem UV.

Istnieje kilka strategii izolowania i czyszczenia interesującego fragmentu DNA.

Ekstrakcja kolumny spinowej

Zestawy do ekstrakcji żelowej są dostępne u kilku głównych producentów biotechnologicznych w cenie około 1-2 USD za próbkę. Protokoły zawarte w tych zestawach na ogół wymagają rozpuszczenia plastra żelu w 3 objętościach czynnika chaotropowego w temperaturze 50°C, a następnie naniesienia roztworu na minikolumnę (DNA pozostaje w kolumnie), 70% etanolu płukanie (DNA pozostaje w kolumnie, sól i zanieczyszczenia są wypłukiwane) i elucja DNA w małej objętości (30 µl) wody lub buforu.

Dializa

Fragment żelu umieszcza się w probówce do dializy , która jest przepuszczalna dla płynów, ale nieprzepuszczalna dla cząsteczek o wielkości DNA, zapobiegając w ten sposób przejściu DNA przez membranę po namoczeniu w buforze TE . Wokół rurki tworzy się pole elektryczne (w sposób podobny do elektroforezy żelowej) wystarczająco długo, aby DNA zostało usunięte z żelu, ale pozostało w probówce. Roztwór z probówki można następnie odpipetować i będzie on zawierał pożądane DNA z minimalnym tłem.

Tradycyjny

Tradycyjna metoda ekstrakcji żelu polega na utworzeniu złożonej kieszeni z woskowanego papieru Parafilm i umieszczeniu w niej fragmentu agarozy. Agaroza jest fizycznie wciskana palcem w róg kieszeni, częściowo upłynniając żel i jego zawartość. Kropelki cieczy można następnie skierować z kieszeni na zewnętrzną część parafilmu, gdzie są one pipetowane do małej rurki. Ekstrakcja butanolem usuwa plamę bromkiem etydyny, a następnie ekstrakcja fenolem/chloroformem oczyszczonego fragmentu DNA.

Wadą izolacji żelowej jest to, że tło można usunąć tylko wtedy, gdy można je fizycznie zidentyfikować za pomocą światła UV. Jeśli dwa pasma znajdują się bardzo blisko siebie, oddzielenie ich bez zanieczyszczenia może być trudne. W celu jednoznacznej identyfikacji pasma będącego przedmiotem zainteresowania mogą być konieczne dalsze trawienia restrykcyjne. Miejsca restrykcyjne charakterystyczne dla niechcianych prążków o podobnej wielkości mogą pomóc w rozbiciu tych potencjalnych zanieczyszczeń.