Ekstrakt z jaj Xenopus

Ekstrakt z jaj Xenopus jest lizatem, który jest przygotowywany przez rozgniatanie jaj afrykańskiej żaby szponiastej Xenopus laevis . Oferuje potężny bezkomórkowy (lub in vitro ) system do badania różnych procesów biologicznych komórki, w tym progresji cyklu komórkowego , transportu jądrowego , replikacji DNA i segregacji chromosomów . Jest również nazywany systemem bez komórek jajowych Xenopus lub ekstraktem bez komórek jajowych Xenopus .

Historia

Pierwszy ekstrakt z jaja żaby został opisany w 1983 roku przez Lohkę i Masui. W tej pionierskiej pracy do przygotowania ekstraktu wykorzystano jaja żaby lamparta północnego Rana pipiens . Później tę samą procedurę zastosowano do jaj Xenopus laevis , które stały się popularne w badaniu progresji cyklu komórkowego i zdarzeń komórkowych zależnych od cyklu komórkowego. Opisano również ekstrakty pochodzące z jaj japońskiej ropuchy szarej Bufo japonicus lub zachodniej żaby szponiastej Xenopus tropicalis .

Podstawy przygotowania ekstraktu

Cykl komórkowy niezapłodnionych jaj X. laevis zostaje zatrzymany wysoce synchronicznie w metafazie mejozy II. Po zapłodnieniu zatrzymanie metafazy jest uwalniane przez działanie jonów Ca ²⁺ uwalnianych z retikulum endoplazmatycznego , inicjując w ten sposób wczesne cykle komórek embrionalnych, w których naprzemiennie występuje faza S ( replikacja DNA ) i faza M ( mitoza ).

Ekstrakt fazy M

Ryc. 1. Ekstrakt jaja przygotowuje się przez zmiażdżenie jaj X. laevis przez odwirowanie

Jaja niezapłodnione w buforze zawierającym chelator Ca2+ EGTA (kwas tetraoctowy glikolu etylenowego) umieszcza się w probówce wirówkowej. Po usunięciu nadmiaru buforu jaja rozdrabnia się przez wirowanie (~10 000 g). Rozpuszczalna frakcja, która pojawia się między czapeczką lipidową a żółtkiem, nazywana jest ekstraktem fazy M. Ekstrakt ten zawiera wysoki poziom cykliny B - Cdk1 . Kiedy pozbawione błony jądra plemników są inkubowane z tym ekstraktem, przechodzi on szereg zmian strukturalnych i ostatecznie przekształca się w zestaw chromosomów fazy M z dwubiegunowymi wrzecionami .

Ekstrakt międzyfazowy (faza S).

Różne rodzaje ekstraktów z jaj

Ekstrakt z kolarstwa

Ryc. 2. Jądro interfazowe (po lewej) i skupisko chromosomów mitotycznych (po prawej) wytworzone w ekstrakcie cyklicznym. Pręt, 10 µm.

Szybkoobrotowy supernatant (HSS)

Ekstrakt nukleoplazmatyczny (NPE)

Odkrycia dokonane przy użyciu ekstraktów z jaj

Oczyszczanie czynnika promującego fazę M (MPF)
Wyjaśnienie roli syntezy i degradacji cykliny B w przebiegu cyklu komórkowego
Odkrycie, że degradacja białka (białek) innego niż cyklina B jest konieczna do zainicjowania segregacji chromosomów
Odkrycie mechanizmu składania wrzeciona zależnego od chromatyny , ale nie od centrosomów
Propozycja systemu licencjonowania replikacji DNA i identyfikacja czynnika odpowiedzialnego za ten proces
Identyfikacja importyny α/β odpowiedzialnej za transport jądrowy
Odkrycie kompleksu kondensyny niezbędnego do składania chromosomów mitotycznych
Identyfikacja kompleksu kohezyny niezbędnego dla spójności chromatyd siostrzanych

Niedawno ekstrakty z jaj zostały wykorzystane do badania przeprogramowania zróżnicowanych jąder, właściwości fizycznych wrzecion i jąder oraz teoretycznego zrozumienia kontroli cyklu komórkowego.

Zobacz też