Epigenetyka i czerniak

Czerniak jest rzadkim, ale agresywnym nowotworem złośliwym wywodzącym się z melanocytów . Te melanocyty to komórki znajdujące się w warstwie podstawnej naskórka , które wytwarzają melaninę pod kontrolą hormonu stymulującego melanocyty . Pomimo faktu, że czerniak stanowi tylko niewielką liczbę wszystkich nowotworów skóry, jest przyczyną ponad 50% zgonów związanych z rakiem. Wysokie właściwości przerzutowe i śmiertelność, a także rozpowszechnienie wśród osób w młodszym wieku sprawiły, że czerniak stał się wysoce przebadanym nowotworem złośliwym. modyfikacje epigenetyczne wpływają na pojawianie się wielu rodzajów chorób nowotworowych, a także podejrzewa się, że odgrywają rolę w rozwoju czerniaka.

W ciągu ostatnich kilku lat zmiany chemiczne w genomie stały się bardziej widoczne, a zmiany te mogą mieć kluczowe znaczenie w rozwoju nowotworów złośliwych. Ten proces zmian jest określany mianem epigenetyki (Patino i in. 2008). Epigenetyka to termin używany w odniesieniu do stabilnych zmian w DNA, które wpływają na ekspresję genów , ale nie pociągają za sobą zmian w podstawowej sekwencji nukleotydowej organizmu (Patino i in. 2008). Mechanizmy, dzięki którym zachodzi epigenetyka, obejmują hipo- i hipermetylację DNA, modyfikacje histonów poprzez acetylację , metylację i fosforylację oraz modyfikacje potranslacyjne , które obejmują wyciszanie RNA . Modyfikacje te mogą powodować występowanie różnych wzorców ekspresji, co może skutkować zmianami w komórkach. Niektóre z tych zmian mogą skutkować tworzeniem się komórek rakowych lub różnymi innymi niebezpiecznymi zmianami w funkcjonowaniu komórek, a także wieloma innymi skutkami, gdy zostaną połączone razem. Komórki rakowe nie powstają z jednej zmiany.

Rola metylacji cytozyny w czerniaku

W zmianach epigenetycznych w raku metylacja DNA jest najlepiej zbadana, chociaż nie jest to jedyna zmiana, która może wystąpić. Metylacja DNA jest kowalencyjną modyfikacją DNA, w której grupa metylowa jest dodawana do pozycji C-5 cytozyny przez metylotransferazy DNA. Dzieje się tak głównie w regionach bogatych w dinukleotydy cytozyna-fosforan-guanina, znanych jako wyspy CpG i są zlokalizowane szczególnie w regionach promotorowych genów w ludzkim genomie (Patino i in. 2008). Te regiony promotora są metylowane w określony sposób lub mogą być całkowicie niemetylowane. Jednak w zmienionej metylacji wysp CpG (zazwyczaj tam, gdzie wzór metylacji jest odwrócony), transkrypcja może ulec zmianie, co może prowadzić do raka. Wynika to z faktu, że chromosomy są silnie skondensowane, co uniemożliwia polimerazie RNA i innym czynnikom transkrypcyjnym rozpoznawanie i wiązanie się z DNA. Może to spowodować wyciszenie genów . To wyciszanie genów może być niebezpieczne dla komórek, zwłaszcza gdy wyciszone geny są aktywne w podtrzymywaniu cyklu komórkowego. Poniższa tabela przedstawia niektóre z ważnych genów, na które ukierunkowana jest hipermetylacja promotora w czerniaku.

TABELA 1. Różne geny będące celem hipermetylacji promotora w czerniaku złośliwym

Gen	Częstość zmian w obrębie czerniaka (%)
RASSF1A	36-57
APC	19
PYCARD	50
RARB	20-70
MGMT	0-34
DAPK	19
3- OST- 2	56
CDKN1B	0-9
INK4A	10-20
HOXB13	20-33
SYK	30-89
PRDX2	8
PTEN	0-62

Niektóre geny, na które wpływa metylacja cytozyny w powstawaniu czerniaka

INK4A

INK4A, znany również jako p16 , jest genem supresorowym guza i stwierdzono, że ma hipermetylowane regiony promotorowe w 10-20% komórek czerniaka i bierze udział w 40-87% zmian genów w przypadkach czerniaka (Gonzalgo i in., 1997) . Oznacza to, że w 10-20% przypadków występuje zmiana epigenetyczna w genie INK4A, aw 40-87% przypadków występuje mutacja nukleotydowa w genie. INK4A jest jednym z genów zmienionych zarówno epigenetycznie, jak i genomowo. Jako regularnie działający gen, INK4A jest supresorem guza, którego działanie polega na hamowaniu powstawania guzów. Hipermetylacja tego genu może spowodować jego inaktywację (Straume i in., 2002). Kiedy INK4 jest inaktywowany przez hipermetylację, powoduje przerwanie genów CDK4 i CDK6 , które normalnie zatrzymują wzrost komórek w fazie G1 podziału komórkowego. Kiedy tak się dzieje, w komórce nie ma regulacji, komórka szybko rośnie i staje się nowotworowa.

SYK

SYK to kolejny gen, na który wpływa metylacja cytozyny podczas progresji raka. Jest to gen, który po hipermetylacji traci swoją funkcję (Muthusamy i in., 2006). Gen ten występuje w 30-89% przypadków czerniaka (Dahl et al., 2007) i powoduje szybki wzrost komórek. Ten szybki wzrost jest ważny w przypadku szybkich przerzutów komórek czerniaka, a po hipermetylacji wzrost i rozprzestrzenianie się komórek znacznie spowalnia (Hoeller i in., 2005). Jest to jednak kontrowersyjne odkrycie z niejednoznacznymi wynikami. Niektóre odkrycia pokazują, że normalnie funkcjonujące geny SYK pomagają w supresji guza, podczas gdy inne badania pokazują, że jest to czynnik transformujący, który ułatwia powstawanie raka. Normalnie funkcjonujący gen SYK wytwarza niereceptorową kinazę białkową, która pomaga w różnicowaniu, proliferacji i fagocytozie wśród wielu innych ważnych procesów. SYK występuje w różnych komórkach, w tym w fibroblastach, komórkach nabłonkowych (gdzie kontroluje podział komórek i działa jako supresor guza), hepatocytach i komórkach neuronalnych (TORCIS Bioscience, 2014). Chociaż SYK nie ma żadnych zgłoszonych modyfikacji DNA, zmiany epigenetyczne nadal powodują wystarczające uszkodzenia komórek. Kiedy wyciszenie SYK jest połączone z innymi zmianami, zarówno genetycznymi, jak i epigenetycznymi, może powstać rak.

Rola modyfikacji histonów w czerniaku

Modyfikacje histonów odgrywają dużą rolę w epigenetyce ze względu na ich bardzo zróżnicowane metody występowania i wpływu. Modyfikacje histonów zachodzą w wielu formach, z których wiele wciąż nie jest jasno zrozumianych. Metylacja, acetylacja, fosforylacja i ubikwitynacja to główne kategorie modyfikacji histonów, przy czym kombinacje zmian skutkują zakresem ekspresji genetycznej.

Metylacja histonów generalnie powoduje wyłączenie genów. Metylacja histonów jest również ważna dla utrzymania heterochromatyny , a niewłaściwa regulacja może prowadzić do nadmiernej lub niedostatecznej ekspresji genów. Ta nadmierna lub niedostateczna ekspresja może prowadzić do powstawania komórek nowotworowych w organizmie. Na drugim końcu spektrum demetylacja powoduje włączenie genów. Ta aktywacja może być równie szkodliwa dla komórek, ponieważ ich procesy są zakłócane przez niepotrzebne produkty genów. Większość metylacji histonów zachodzi w regionie promotora i jest podobna do metylacji cytozyny pod względem procesu i funkcji.

Acetylacja histonów jest generalnie związana z aktywacją transkrypcji, co może powodować kodowanie i ekspresję pewnych białek, gdy nie powinny. Może to potencjalnie prowadzić do raka. I odwrotnie, deacetylacja genów powoduje zahamowanie transkrypcji, zamykając ważne procesy biologiczne w komórce. W czerniaku stwierdzono, że Ku70 i Ku86 zaangażowane w naprawę DNA są inaktywowane, gdy deacetylaza histonowa lub HDAC została wystawiona na działanie genu (Munshi i in., 2005).

Fosforylacja histonów to proces, w którym grupa fosforanowa jest dodawana do ogonów histonów. Proces ten drastycznie zmienia strukturę i kształt histonów. Odkryto, że fosforylacja powoduje zmiany potranslacyjne, w których znaleziono domeny wiążące, oprócz regulacji naprawy DNA, regulacji transkrypcji i kondensacji chromatyny. Jedną z głównych fosforylacji w naprawie DNA jest lokalizacja H2AX. Kiedy H2AX jest fosforylowany, rozprzestrzenia się przez pęknięcie DNA i uważa się, że rekrutuje acetylotransferazy w celu rozluźnienia DNA i umożliwienia białkom naprawczym dostępu do uszkodzonej części (Rossetto i in., 2012). Fosforylacja histonów rozpoczyna proces naprawy DNA i jest ważna dla zasygnalizowania rozpoczęcia innych procesów, w tym podziału komórki. H2AX jest wskaźnikiem czerniaka ze względu na jego wysoką korelację z niestabilnością chromosomów (Warters i in., 2005). Kiedy obecne są wysokie poziomy H2AX, zachodzi większa fosforylacja i chromosomy są bardziej podatne na uszkodzenia. Wykazano, że fosforylacja histonów H3S10 wiąże się z acetylacją H3, która jest integralną częścią aktywacji transkrypcji (Rossetto i in., 2012). Jeśli transkrypcja jest zmieniona, komórki są generalnie negatywnie dotknięte i reagują w niekorzystny sposób, który może zaszkodzić organizmowi.

Role mikroRNA odgrywają w rozwoju czerniaka

Naukowcy zastanawiali się, w jaki sposób komórki czerniaka przemieszczają się z głównych guzów znajdujących się na powierzchni skóry do wątroby, mózgu, płuc i innych narządów, gdzie stają się bardzo destrukcyjne, oporne na leczenie, a nawet powodują śmierć. Prowadzone badania próbują odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób i dlaczego komórki czerniaka stają się wadliwe i szkodzą ludziom. Wiele badań wykazało, że niektóre klasy krótkich nici RNA, zwanych mikroRNA , są powiązane ze szkodliwymi właściwościami komórek czerniaka.

MikroRNA (miRNA) to niekodujące RNA o długości około 20-22 nukleotydów. Działają w posttranskrypcyjnej regulacji genów, zapobiegając produkcji określonego białka. Mogą to zrobić na wiele sposobów, takich jak wiązanie i niszczenie matrycowego RNA, które w przeciwnym razie wytworzyłoby białko. Wykazano również, że miRNA wiążą się bezpośrednio z informacyjnym RNA i wyciszają je, zanim będą mogły zostać przetłumaczone na białka, które odegrałyby ważną rolę w transkrypcji (O'Donnell i in., 2005). W ludzkim genomie znajduje się około 1000 miRNA, a około 33% wszystkich ludzkich informacyjnych RNA znajduje się pod ich kontrolą (Liu i in. 2012).

MiRNA działają w kilku obszarach procesów biologicznych, w tym w różnicowaniu, proliferacji i apoptozie. Stwierdzono również, że odgrywają one ważną rolę w rozwoju nowotworów. Niektóre z tych niekodujących RNA, w tym miRNA-205, zostały ostatnio powiązane z nadmierną lub niedostateczną ekspresją kilku genów związanych z rakiem i innymi chorobami zagrażającymi życiu, takimi jak choroby serca, i wykazano zmiany w ich ekspresji wpływać na wzrost, przeżycie i zdolność do rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych (Liu et al. 2012). Na przykład utrata ekspresji miRNA-205 jest związana z przerzutami czerniaka (Liu i wsp. 2012). Nadprodukcja MiRNA może spowodować epigenetyczne wyciszenie wielu ważnych genów, takich jak MITF, FOXO3, TFAP2C, CCND1, ITGA3 i c-KIT, potrzebnych w regulacji cyklu komórkowego, a to może spowodować, że komórka stanie się nowotworowa (He i in., 2005).

MikroRNA i geny zaangażowane w czerniaka

Stwierdzono, że określony miRNA, MiR-182, wpływa na MITF i FOXO3 , które są genami supresorowymi nowotworów. MiR-182 jest członkiem klastra miRNA w locus chromosomalnym, który jest najczęściej amplifikowany w czerniaku (Segura i wsp. 2009). W próbkach tkanek i liniach komórkowych ludzkiego czerniaka jest często regulowany w górę, a ten wzrost powoduje jego ekspresję ektopową, która stymuluje migrację komórek czerniaka, zarówno in vitro, jak i in vivo. Obniżenie tego miRNA wyzwala apoptozę. Wykazano, że nadekspresja miR-182 w nowotworach złośliwych negatywnie wpływa na te geny supresorowe guza poprzez ich bezpośrednią represję. Represja tych genów pozwala miRNA promować rozprzestrzenianie się i migrację komórek czerniaka, nie biorąc pod uwagę właściwości niezbędnych do wystąpienia przerzutów.

W dość niedawnym eksperymencie przeprowadzonym przez Penna i in. na miRNA-214 wykazano, że miRNA reguluje ekspresję panelu 11 docelowych genów, w tym TFAP2C i ITGA3 , i przyczynia się do progresji nowotworu czerniaka poprzez supresję tych genów. W tym eksperymencie uzyskano te geny, o których wiadomo, że zawierają jedno lub więcej miejsc wiązania miRNA, a ich trzy główne nieulegające translacji regiony (3'UTR) sklonowano do wektora. lucyferazy w komórkach MA-2 i/lub MC-1 transfekowanych miRNA. Doniesiono, że ekspresja lucyferazy, która była napędzana przez 3'UTR integryny alfa 3 (ITGA3) lub czynnika transkrypcyjnego AP - 2 gamma (TFAP2C), była znacząco represjonowana. Następnie zespół próbował ocenić, czy regulacja ekspresji lucyferazy obserwowana w genach ITGA3 i TFAP2C zależała od wiązania między miRNA a sekwencją komplementarną obecną w 3'UTR obu genów. Delecja czterech nukleotydów lub trzy mutacje punktowe zostały odpowiednio wstawione do 3'UTR ITGA3 lub TFAP2C, a zmiany 3'UTR całkowicie zniosły wpływ nadekspresji miRNA na ekspresję lucyferazy w komórkach MA-2 i MC-1. Ta obserwacja wskazuje na bezpośrednią regulację miRNA-214 w miejscach wiązania 3'UTR genów ITGA3 i TFAP2C.

Dalsze eksperymenty dotyczące ekspresji białek przeprowadzono również na tych dwóch konkretnych genach, TFAP2C i ITGA3, i wykazano, że nadekspresja miRNA-214 doprowadziła do 30-90% spadku białka w ITGA3 i 40-80% spadku TFAP2C ( Penna i in., 2011). Konsekwentnie, białka były regulowane w górę o 20% w ITGA3 i 40% w TFAP2C, gdy miRNA-214 zostało wyciszone w komórce MC-1. Sugeruje to, że miRNA-214 w istotny sposób reguluje ekspresję genów ITGA3 i TFAP2C oraz sprzyja progresji nowotworu czerniaka, gdy jest nadmiernie wyrażany.

TABELA 2. Różne geny zmienione przez ogólne mutacje lub amplifikację w czerniaku złośliwym

Typ genu	Nazwa genu	Typ zmiany	Częstość zmian w obrębie czerniaka (%)
Protoonkogeny	NRAS	Mutacja	15-25
	BRAF	Mutacja	50-70
	ZESTAW	Mutacja	2-10
	CDK4	Mutacja, amplifikacja	0-9
	CTNNB1	Mutacja	2- 23
	MITF	Wzmocnienie	10-16
	CCND1	Wzmocnienie	6- 44
	PIK3CA	Mutacja	<5
	AKT3	Wzmocnienie	40-60
Geny supresorowe nowotworów	INK4A	Mutacja	40-87
	ARF	Mutacja	40-70
	PTEN	Mutacja	5-40
	TP53	Mutacja	0- 25

Wiele genów jest zmienionych genetycznie i epigenetycznie w nowotworach, co jest jednym z powodów, dla których tak trudno jest zwalczyć raka. INK4A i PTEN to dwa geny, które znajdują się w obu tabelach 1 i 2 powyżej, ponieważ są one zmutowane epigenetycznie i genetycznie w przypadkach czerniaka. Nie jest to rzadkie, ponieważ komórki potrzebują wielu zmian w genomie, aby zainicjować zmianę tak dużą jak rak. Epigenetyczna strona badań nad rakiem rozwija się i odkrywa wiele nakładek, jak w przypadku INK4A i PTEN, dając większy, dokładniejszy obraz raka i czerniaka. Złożoność i zmienność epigenetyki nowotworów sprawia, że jest to rozwijająca się i ważna dziedzina. Ponieważ modyfikacje epigenetyczne można odwrócić, czyni je to celem terapeutycznym i częścią przyszłości walki z rakiem, a zwłaszcza czerniakiem, ze względu na jego śmiertelność i trudność w złapaniu. Wymienione powyżej geny to tylko początek długiej listy dostępnych obszarów leczenia, które mogą potencjalnie odwrócić lub zapobiec czerniakowi, jeśli zostaną wcześnie wykryte.

Źródła

Penna, Elisa i in. 2011. „MicroRNA-214 przyczynia się do progresji guza czerniaka poprzez supresję TFAP2C”. Dziennik EMBO, tom. 30, nr 10.
Segura, Miguel i in. 2009. „Nieprawidłowa ekspresja miR-182 sprzyja przerzutom czerniaka poprzez represję FOXO3 i czynnika transkrypcyjnego związanego z mikroftalmią”. Dziennik CrossMark, tom. 106, nr 6.
Liu, Shujing i in. 2012. „Utrata ekspresji mikroRNA-205 jest związana z progresją czerniaka”. Badanie laboratoryjne, tom. 92, nr 1084-1096.
Patino, Willmar D. i Joseph Susa. „Epigenetyka czerniaka skóry”. Postępy w dermatologii 24 (2008): 59-70. Wydrukować.
Saha, K., Hornyak, TJ, Eckert, RL 2013. „Mechanizmy zapobiegania rakowi epigenetycznemu w raku skóry”. Dziennik AAPS, tom. 15, nr 4.
Dahl C, Guldberg P. 2007. „Genom i epigenom czerniaka złośliwego”. APMIS, tom. 115:1161–1176. Odniesiono się również do tabel 1 i 2
Wan, PT, Garnett, MJ, Roe, SM, Lee, S., Niculescu-Duvaz, D., Good, VM i in. 2004. „Mechanizm aktywacji szlaku sygnałowego RAF-ERK przez onkogenne mutacje B-RAF”. Komórka, tom. 116: 855–67.
H. Sumimoto, M. Miyagishi, H. Miyoshi, S. Yamagata, A. Shimizu, K. Taira i in. 2004. „Hamowanie wzrostu i inwazyjności czerniaka przez inaktywację zmutowanego BRAF z interferencją RNA za pośrednictwem lentiwirusa”. Onkogen, tom 23:6031–9.
Eskadarpour, M., Kiaii, S., Zhu, C., Castro, J., Sakko, AJ, Hansson, J. 2005. „Tłumienie onkogennych NRAS przez interferencję RNA indukuje apoptozę ludzkich komórek czerniaka”. International Journal of Cancer, tom 115: 65–73.
Demunter, A., Staś, M., Degreef, H., De Wolf-Peeters, C., van den Oord, JJ 2005. „Analiza mutacji N- i K-RAS w charakterystycznych fazach progresji czerniaka”. Journal of Investigative Dermatology, tom 117: 1483–9.
Stahl, JM, Sharma, A., Cheung, M., Zimmerman, M., Cheng, JQ, Bosenberg, MW, i in. 2004. „Deregulacja aktywności Akt3 sprzyja rozwojowi czerniaka złośliwego”. Rak Res. tom 64: 7002–10.
Gonzalgo, ML, Bender, CM, You, EH, Glendening, JM, Flores, JF, Walker, GJ i in. 1997. „Niska częstotliwość metylacji p16/CDKN2A w sporadycznym czerniaku: podejścia porównawcze do analizy metylacji guzów pierwotnych”. Rak Res. tom 57: 5336–47.
Straume, O., Smeds, J., Kumar, R., Hemminki, K., Akslen, LA 2002. „Znaczący wpływ hipermetylacji promotora i polimorfizmu 540 CT CDKN2A w czerniaku skóry w fazie wzrostu pionowego”. American Journal of Pathology tom 161: 229–37.
Rothhammer, T., Bosserhoff AK 2007. „Epigenetyczne zdarzenia w czerniaku złośliwym”. Komórki Pigmentu Res. tom 20; 92–111.
Muthusamy, V., Duraisamy, S., Bradbury, CM, Hobbs, C., Curley, DP, Nelson, B. i Bosenberg, M. 2006. „Epigenetyczne wyciszanie nowych supresorów nowotworów w czerniaku złośliwym”. Rak Res. tom 66, 11187–11193.
Hoeller C, Thallinger C, Pratscher B i in. 2005. „Niezwiązana z receptorem kinaza tyrozynowa Syk jest regulatorem zachowania przerzutowego w ludzkich komórkach czerniaka”. Journal of Investigative Dermatology tom 124: 1293–9.
Centrum Medyczne NYU Langone / Szkoła Medyczna Uniwersytetu Nowojorskiego. „Mikro RNA odgrywa kluczową rolę w przerzutach czerniaka”. ScienceDaily. ScienceDaily, 2009.
O'Donnell KA, Wentzel EA, Zeller KI, Dang CV, Mendell JT. 2005. „mikroRNA regulowane c-Myc modulują ekspresję E2F1”. Natura. Tom 435, wydanie 7043: 839–43.
On L, Thomson JM, Hemann MT, Hernando-Monge E, Mu D, Goodson S, Powers S, Cordon-Cardo C, Lowe SW, Hannon GJ, Hammond SM. 2005. „Policystron mikroRNA jako potencjalny ludzki onkogen”. Natura. Tom 435, wydanie 7043: 828–33.
A. Munshi, JF Kurland, T. Nishikawa i in. 2005. „Inhibitory deacetylazy histonowej uwrażliwiają komórki ludzkiego czerniaka na promieniowanie poprzez tłumienie aktywności naprawy DNA”. Clin Cancer Res. tom 11:4912-4922.
Rossetto, D., Avvakumov, N., Côté, J. 2012. „Fosforylacja histonów: modyfikacja chromatyny zaangażowana w różne zdarzenia jądrowe”. Epigenetyka. Tom 7, 10:1098-108.
Warters, RL, Adamson, PJ, Pond, CD, Leachman, SA 2005. „Komórki czerniaka wyrażają podwyższone poziomy fosforylowanych ognisk H2AX histonu”. Journal of Investigative Dermatology. Tom 124, 807–817.