Fluorescencyjna spektroskopia korelacji krzyżowej

Spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji ( FCCS ) została wprowadzona przez Eigena i Riglera w 1994 r. I zrealizowana eksperymentalnie przez Schwille'a w 1997 r. Zasadniczo jest to rozszerzenie procedury spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS) poprzez wykorzystanie dwóch różnie zabarwionych cząsteczek zamiast jednej. Innymi słowy, zbieżne fluktuacje natężenia zielonego i czerwonego różnych cząsteczek są skorelowane z tym, czy cząstki oznakowane na zielono i czerwono poruszają się razem przez określoną objętość konfokalną. W rezultacie FCCS zapewnia wysoce czuły pomiar interakcji molekularnych, niezależny od szybkości dyfuzji. Jest to ważny postęp, biorąc pod uwagę, że szybkość dyfuzji zależy tylko w niewielkim stopniu od wielkości kompleksu molekularnego.

Kreskówka objętości ogniskowej FCCS

FCCS wykorzystuje dwa gatunki, które są niezależnie znakowane za pomocą dwóch różnokolorowych sond fluorescencyjnych. Te sondy fluorescencyjne są wzbudzane i wykrywane przez dwa różne źródła światła laserowego i detektory, zwykle oznaczone jako „zielony” i „czerwony”. Zwykle stosuje się mikroskop konfokalny , aby uzyskać nakładające się zielone i czerwone ogniskowe objętości do wzbudzenia.

Symulacje FCCS przedstawiające cząstki nieoddziałujące (po lewej) oraz mieszaninę cząstek oddziałujących i niezależnych (po prawej)

Znormalizowana funkcja korelacji krzyżowej jest zdefiniowana dla dwóch gatunków fluorescencyjnych i ${\ displaystyle$ $\ R}$ , które są niezależnymi kanałami zielonym, G i czerwonym, R w następujący sposób: sol {\ displaystyle \ G

${\ Displaystyle \ G_ {GR} (\ tau) = 1 + {\ Frac {\ langle \ delta I_ {G} (t) \ delta I_{R}(t+\tau )\rangle }{\langle I_{G}(t)\rangle \langle I_{R}(t)\rangle }}={\frac {\langle I_{G}(t )I_{R}(t+\tau )\rangle }{\langle I_{G}(t)\rangle \langle I_{R}(t)\rangle }}}$

gdzie różnicowe sygnały fluorescencyjne $}}$ czasie i w czasie opóźnienia, ja sol $G$ $\ \ delta I_$ ${\ displaystyle \ \ tau}$ później jest ze sobą skorelowane. W przypadku braku przenikania widmowego funkcja korelacji krzyżowej wynosi zero dla cząstek nieoddziałujących. W przeciwieństwie do FCS, funkcja korelacji krzyżowej wzrasta wraz ze wzrostem liczby oddziałujących cząstek.

FCCS jest wykorzystywany przede wszystkim do pomiarów interakcji biomolekularnych zarówno w żywych komórkach, jak i in vitro. Można go wykorzystać do pomiaru prostych stechiometrii molekularnych i stałych wiązania. Jest to jedna z niewielu technik, które mogą dostarczyć informacji o interakcjach białko-białko w określonym czasie i miejscu w żywej komórce. W przeciwieństwie do przenoszenia energii rezonansu fluorescencji , nie ma ograniczenia odległości dla interakcji. W rezultacie można go wykorzystać do sondowania dużych kompleksów. Niemniej jednak wymaga to, aby kompleksy aktywnie dyfundowały przez ognisko mikroskopu w stosunkowo krótkiej skali czasu (zwykle sekundy).

Modelowanie

Krzywe korelacji krzyżowych są modelowane według nieco bardziej skomplikowanej funkcji matematycznej niż stosowana w FCS. Przede wszystkim efektywna nałożona objętość obserwacji, w której kanały G i R tworzą pojedynczą objętość obserwacji w rozwiązaniu: $\ Displaystyle \ V_ {eff, RG}}$

${\ styl wyświetlania \ V_{eff,RG}=\pi ^{3/2}(\omega _{xy,G}^{2}+\omega _{xy,R}^{2})(\omega _{z ,G}^{2}+\omega _{z,R}^{2})^{1/2}/2^{3/2}}$

gdzie ${\ Displaystyle \ \ omega _ {xy, G} ^ {2}}$ i są promieniowe ${\ Displaystyle \ \ omega _ {xy, R} ^ {2}}$ parametry i i ${$ $\ omega _ {z, R}}$ odpowiednio dla kanałów G i R. z

Czas dyfuzji dla podwójnie ( ${\ displaystyle \ \ tau _ {D, GR}}$ i R) fluorescencyjnych gatunków jest zatem opisany następująco:

${\ Displaystyle \ \ tau _ {D, GR} = {\ Frac {\ omega _ {xy, G} ^ { 2}+\omega _{xy,R}^{2}}{8D_{GR}}}}$

gdzie $dyfuzji$ cząstki podwójnie fluorescencyjnej

Krzywą korelacji krzyżowej wygenerowaną z dyfuzji podwójnie znakowanych cząstek fluorescencyjnych można modelować w oddzielnych kanałach w następujący sposób:

${\ Displaystyle \ G_ {G} (\ tau) = 1 + {\ Frac {(<C_ {G}> różnica_ {k} (\ tau) + <C_ {GR}> różnica_ {k }(\tau ))}{V_{eff,GR}(<C_{G}>+<C_{GR}>)^{2}}}}$

${\ Displaystyle \ G_ {R} (\ tau) = 1 + {\ Frac {(<C_ {R}> różnica_ {k} (\ tau) + <C_ {GR}> różnica_ {k }(\tau ))}{V_{eff,GR}(<C_{R}>+<C_{GR}>)^{2}}}}$

W idealnym przypadku funkcja korelacji krzyżowej jest proporcjonalna do stężenia podwójnie znakowanego kompleksu fluorescencyjnego:

${\ Displaystyle \ G_ {GR} (\ tau) = 1 + {\ Frac {<C_ {GR}> Diff_ {GR} (\ tau)} {V_ {eff} (<C_ {G}> + <C_ {GR}>)(<C_{R}>+<C_{GR}>)}}}$

z ${\ Displaystyle \ Diff_ {k} (\ tau) = { \frac {1}{(1+{\frac {\tau}}{\tau _{D,i}}})(1+a^{-2}({\frac {\tau}}{\tau _{ D,i}}})^{1/2}}}}$

Amplituda korelacji krzyżowej jest wprost proporcjonalna do stężenia podwójnie znakowanych (czerwonych i zielonych) form

Zobacz też

Linki zewnętrzne

Korelacja krzyżowa fluorescencji (FCCS) (Becker & Hickl GmbH, strona internetowa)