Fluorescencyjna spektroskopia korelacyjna

Spektroskopia korelacji fluorescencji ( FCS ) to analiza statystyczna, poprzez korelację czasową, stacjonarnych fluktuacji intensywności fluorescencji . Jej teoretyczne podstawy wywodzą się z hipotezy regresji L. Onsagera . Analiza dostarcza parametrów kinetycznych procesów fizycznych leżących u podstaw fluktuacji. Jednym z interesujących zastosowań jest analiza fluktuacji stężenia cząstek (cząsteczek) fluorescencyjnych w roztworze. W tym zastosowaniu obserwuje się fluorescencję emitowaną z bardzo małej przestrzeni w roztworze zawierającym niewielką liczbę cząstek (cząsteczek) fluorescencyjnych. Intensywność fluorescencji zmienia się z powodu ruchów Browna cząstek. Innymi słowy, liczba cząstek w podprzestrzeni określonej przez układ optyczny zmienia się losowo wokół średniej liczby. Analiza daje średnią liczbę cząstek fluorescencyjnych i średni czas dyfuzji, gdy cząstka przechodzi przez przestrzeń. Ostatecznie określa się zarówno stężenie, jak i rozmiar cząstki (cząsteczki). Oba parametry są ważne w badaniach biochemicznych, biofizyce i chemii.

FCS jest tak czułym narzędziem analitycznym, ponieważ obserwuje niewielką liczbę cząsteczek (stężenia od nanomolowych do pikomolowych) w małej objętości (~1μm ³ ). W przeciwieństwie do innych metod (takich jak HPLC ) FCS nie ma fizycznego procesu separacji; zamiast tego osiąga rozdzielczość przestrzenną dzięki swojej optyce. Ponadto FCS umożliwia obserwację cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie na szlaku biochemicznym w nienaruszonych żywych komórkach. Otwiera to nowy obszar, „biochemia in situ lub in vivo”: śledzenie szlaku biochemicznego w nienaruszonych komórkach i narządach.

Zwykle FCS jest stosowany w kontekście mikroskopii optycznej , w szczególności mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii wzbudzenia dwufotonowego . W tych technikach światło skupia się na próbce, a zmierzone fluktuacje intensywności fluorescencji (spowodowane dyfuzją , reakcjami fizycznymi lub chemicznymi, agregacją itp.) są analizowane za pomocą autokorelacji czasowej. Ponieważ mierzona właściwość jest zasadniczo związana z wielkością i/lub ilością fluktuacji, istnieje optymalny reżim pomiarowy na poziomie, w którym poszczególne gatunki wchodzą lub wychodzą z obszaru obserwacji (lub włączają się i wyłączają w obszarze). Gdy mierzonych jest zbyt wiele obiektów w tym samym czasie, ogólne fluktuacje są małe w porównaniu z całkowitym sygnałem i mogą nie być możliwe do rozwiązania – z drugiej strony, jeśli poszczególne fluktuacje-zdarzenia są zbyt rzadkie w czasie, jeden pomiar może trwać zbyt długi. FCS jest w pewnym sensie fluorescencyjnym odpowiednikiem dynamicznego rozpraszania światła , które wykorzystuje spójne rozpraszanie światła zamiast (niespójnej) fluorescencji.

Gdy znany jest odpowiedni model, FCS można wykorzystać do uzyskania informacji ilościowych, takich jak np

• współczynniki dyfuzji
• promienie hydrodynamiczne
• średnie stężenia
• kinetyczne szybkości reakcji chemicznych
• dynamika singletowo-trypletowa

Ponieważ markery fluorescencyjne występują w różnych kolorach i mogą być specyficznie związane z określoną cząsteczką (np. białkami, polimerami, kompleksami metali itp.), możliwe jest badanie zachowania poszczególnych cząsteczek (w krótkich odstępach czasu w roztworach złożonych) . Wraz z rozwojem czułych detektorów, takich jak fotodiody lawinowe, wykrywanie sygnału fluorescencji pochodzącego z pojedynczych cząsteczek w bardzo rozcieńczonych próbkach stało się praktyczne. Dzięki temu pojawiła się możliwość przeprowadzania eksperymentów FCS na szerokiej gamie próbek, od materiałoznawstwa po biologię. Pojawienie się zmodyfikowanych komórek z genetycznie znakowanymi białkami (takimi jak białko zielonej fluorescencji ) sprawiło, że FCS stało się powszechnym narzędziem do badania dynamiki molekularnej w żywych komórkach.

Historia

Techniki korelacji sygnałów zostały po raz pierwszy zastosowane eksperymentalnie do fluorescencji w 1972 roku przez Magde'a, Elsona i Webba, których w związku z tym powszechnie uważa się za „wynalazców” FCS. Technika ta została wkrótce potem rozwinięta w grupie artykułów tych i innych autorów, ustanawiając teoretyczne podstawy i rodzaje zastosowań. Około roku 1990, wraz z możliwością wykrywania wystarczająco małej liczby cząstek fluorescencyjnych, pojawiły się dwa zagadnienia: niegaussowski rozkład natężenia fluorescencji oraz trójwymiarowa konfokalna objętość pomiarowa systemu mikroskopii laserowej. Pierwsza z nich doprowadziła do analizy rozkładów i momentów sygnałów fluorescencyjnych w celu wydobycia informacji molekularnych, co ostatecznie stało się zbiorem metod znanych jako analizy jasności . Zobacz Thompson (1991), aby zapoznać się z przeglądem tego okresu.

Począwszy od 1993 roku, szereg ulepszeń w technikach pomiarowych - zwłaszcza przy użyciu mikroskopii konfokalnej, a następnie mikroskopii dwufotonowej - w celu lepszego zdefiniowania objętości pomiaru i odrzucenia tła - znacznie poprawiło stosunek sygnału do szumu i umożliwiło czułość pojedynczej cząsteczki. Od tego czasu zainteresowanie FCS ponownie wzrosło, a od sierpnia 2007 r. w Web of Science znaleziono ponad 3000 artykułów wykorzystujących FCS. Zobacz recenzję Krichevsky'ego i Bonneta. Ponadto nastąpiła lawina działań rozszerzających FCS na różne sposoby, na przykład do skanowania laserowego i mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem (od stacjonarnego pomiaru w jednym punkcie), przy użyciu korelacji krzyżowej (FCCS) między dwoma kanałami fluorescencyjnymi zamiast autokorelacji oraz w wykorzystaniu transferu energii rezonansu Förstera (FRET) zamiast fluorescencji.

Typowa konfiguracja FCS

Typowa konfiguracja FCS

Typowa konfiguracja FCS składa się z linii laserowej (długości fal w zakresie typowo od 405–633 nm ( cw ) i od 690–1100 nm (impulsowo)), która jest odbijana w obiektywie mikroskopu przez lustro dichroiczne. Wiązka laserowa jest skupiona w próbce, która zawiera cząsteczki (cząsteczki) fluorescencyjne w tak dużym rozcieńczeniu, że tylko kilka znajduje się w ognisku (zwykle 1–100 cząsteczek w jednym fl). Kiedy cząstki przekraczają objętość ogniskową, fluoryzują. Światło to jest zbierane przez ten sam obiektyw, a ponieważ jest przesunięte ku czerwieni w stosunku do światła wzbudzenia, przechodzi przez lustro dichroiczne, docierając do detektora, zwykle fotopowielacza, detektora fotodiod lawinowych lub nadprzewodnikowego detektora pojedynczych fotonów . Wynikowy sygnał elektroniczny może być przechowywany bezpośrednio jako wykres intensywności w funkcji czasu do późniejszej analizy lub obliczany w celu bezpośredniego wygenerowania autokorelacji ( co wymaga specjalnych kart akwizycji). Sama krzywa FCS reprezentuje jedynie widmo czasowe. Wnioski dotyczące zjawisk fizycznych należy stamtąd wyciągać za pomocą odpowiednich modeli. Interesujące parametry znajdują się po dopasowaniu krzywej autokorelacji do modelowanych form funkcyjnych.

Objętość pomiaru

Objętość pomiarowa jest splotem geometrii oświetlenia (wzbudzenia) i detekcji, które wynikają z zastosowanych elementów optycznych. Wynikowa objętość jest opisana matematycznie przez funkcję rozproszenia punktowego (lub PSF), jest to zasadniczo obraz źródła punktowego. PSF jest często opisywany jako elipsoida (z nieostrymi granicami) o średnicy ogniska kilkuset nanometrów i prawie jeden mikrometr wzdłuż osi optycznej. Kształt różni się znacznie (i ma duży wpływ na otrzymane krzywe FCS) w zależności od jakości elementów optycznych (konieczne jest uniknięcie astygmatyzmu i sprawdzenie rzeczywistego kształtu PSF na instrumencie). W przypadku mikroskopii konfokalnej i małych otworków (około jednej jednostki Airy'ego) PSF jest dobrze przybliżony przez Gaussa:

${\ Displaystyle PSF (r, z) = I_ {0} e ^ {- 2r ^ { 2}/\omega _{xy}^{2}}e^{-2z^{2}/\omega _{z}^{2}}}$

gdzie jest intensywność piku, r i z to położenie promieniowe i osiowe, a i $ω$$\ Displaystyle \ omega _ {xy}}$ i $\ Displaystyle \ omega _ {z} }$ to promieniowe i osiowe promienie i ${\ Displaystyle \ omega _ {z}> \ omega _ {xy}}$ . Ta forma Gaussa jest przyjmowana przy wyprowadzaniu funkcjonalnej postaci autokorelacji.

Zwykle $200–300$ nm , a jest $_$ Jednym z powszechnych sposobów kalibracji parametrów objętości pomiarowej jest wykonanie FCS na gatunku o znanym współczynniku dyfuzji i stężeniu (patrz poniżej). Współczynniki dyfuzji dla powszechnych fluoroforów w wodzie podano w dalszej części.

Przybliżenie Gaussa działa w różnym stopniu w zależności od szczegółów optycznych, a czasami można zastosować poprawki, aby zrównoważyć błędy w przybliżeniu.

Funkcja autokorelacji

Surowe dane FCS i dane skorelowane.

$\ tau$ to korelacja szeregu czasowego z samym sobą przesuniętym o czas jako funkcja : $displaystyle$ }

${\ displaystyle G(\tau)={\frac {\langle \delta I(t)\delta I(t+\tau)\rangle }{\langle I(t)\rangle ^{2}}}={\frac { \langle I(t)I(t+\tau )\rangle }{\langle I(t)\rangle ^{2}}}-1}$

gdzie ${\ Displaystyle \ delta I (t) = ja (t) - \ langle I (t) \ rangle}$ jest odchyleniem od średniej intensywności. Normalizacja (mianownik) $\tau =0$ tutaj najczęściej stosowana dla FCS, ponieważ wtedy korelacja przy G ( (0), is related to the average number of particles in the measurement volume.

Jako przykład, surowe dane FCS i ich autokorelacja dla swobodnej dyfuzji rodaminy 6G pokazano na rysunku po prawej stronie. Wykres na górze pokazuje intensywność fluorescencji w funkcji czasu. Intensywność zmienia się, gdy rodamina 6G wchodzi i wychodzi z ogniska. Na dolnym wykresie znajduje się autokorelacja na tych samych danych. Informacje o szybkości dyfuzji i stężeniu można uzyskać za pomocą jednego z opisanych poniżej modeli.

Dla profilu oświetlenia Gaussa funkcja autokorelacji jest dana ogólnym wzorem głównym ${\ Displaystyle PSF (r, z)}$

${\ Displaystyle G (\ tau )={\frac {1}{\langle N\rangle }}\left\langle \exp \left(-{\frac {\Delta X(\tau )^{2}+\Delta Y(\tau ) ^{2}}{w_{xy}^{2}}}-{\frac {\Delta Z(\tau)^{2}}{w_{z}^{2}}}\right)\right\ zakres ,}$

gdzie wektor $Y (\ tau), \ Delta Z (\ tau)}}$${\ Displaystyle \ Delta {\ vec {R}} (\ tau) = (\ Delta X (\ tau), \$$Delta$ oznacza stochastyczne przemieszczenie fluoroforu w przestrzeni po . Wyrażenie jest ważne, jeśli średnia liczba $objętości$ ogniskowej jest niska i jeśli ciemne stany itp. fluoroforu można zignorować W szczególności nie przyjęto żadnego założenia co do rodzaju badanego ruchu dyfuzyjnego. ${$ pozwala na interpretację jako prawdopodobieństwa powrotu dla parametrów małej wiązki $z}}$ oraz (ii) funkcja generująca moment $} (\ tau) | ^$$\ Displaystyle |\ Delta {\ vec {R$ jeśli zróżnicowane

Interpretacja funkcji autokorelacji

Aby wyodrębnić interesujące nas wielkości, można dopasować dane autokorelacji, zwykle przy użyciu nieliniowego algorytmu najmniejszych kwadratów . Forma funkcjonalna dopasowania zależy od rodzaju dynamiki (i danej geometrii optycznej).

Normalna dyfuzja

Skorelowane dane i normalny model dyfuzji

Cząsteczki fluorescencyjne stosowane w FCS są małe i dlatego podlegają ruchom termicznym w roztworze. Najprostszym eksperymentem FCS jest więc normalna dyfuzja 3D, dla której autokorelacja to:

${\ Displaystyle \ G (\ tau) = G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{D}))^{1 /2}}}+G(\infty)}$

gdzie za $\ Displaystyle a = \ omega _ {z} / \ omega _ {xy}}$ to stosunek promieni osiowych do promieniowych mi $\ Displaystyle e ^ {- 2}}$$.$ pomiaru, a czas przebywania Ta postać została wyprowadzona przy założeniu objętości pomiarowej Gaussa. $)}$ dopasowanie miałoby trzy wolne parametry - i - których współczynnik dyfuzji i fluorofor ${\ Displaystyle G (\ infty$ można uzyskać koncentrację.

Przy normalizacji zastosowanej w poprzedniej sekcji, G (0) daje średnią liczbę dyfuzorów w objętości <N> lub równoważnie — przy znajomości wielkości objętości obserwacyjnej — średnie stężenie:

${\ Displaystyle \ G (0) = {\ Frac {1} {\ langle N \ rangle}} = {\ Frac {1} {V_ {\ text{eff}}\langle C\rangle }},}$

gdzie efektywna objętość jest obliczana na podstawie całkowania postaci Gaussa objętości pomiarowej i jest dana wzorem:

${\ Displaystyle \ V_ {\ tekst {eff}} = \ pi ^ {3/2} \ omega _ {xy} ^ {2} \ omega _ {z}. \,} D daje współczynnik dyfuzji$

:

${\ Displaystyle \ D = \ omega _ {xy} ^ {2} / {4 \ tau _ {D}}.}$

Anomalna dyfuzja

Zobacz też: Anomalna dyfuzja

Jeśli dyfundujące cząstki są powstrzymywane przez przeszkody lub popychane przez siłę (silniki molekularne, przepływ itp.), Dynamika często nie jest wystarczająco dobrze opisana przez normalny model dyfuzji, w którym średnie przemieszczenie kwadratowe (MSD) rośnie liniowo w czasie . Zamiast tego dyfuzję można lepiej opisać jako anomalną dyfuzję , gdzie zależność czasowa MSD jest nieliniowa, jak w prawie potęgowym:

${\ Displaystyle \ MSD = 6D_ {a} t ^ {\ alfa} \,}$

gdzie $.$ anomalnym współczynnikiem „Anomalna dyfuzja” zwykle odnosi się tylko do tego bardzo ogólnego modelu, a nie do wielu innych możliwości, które można by opisać jako anomalne. Ponadto prawo potęgowe jest w ścisłym tego słowa znaczeniu oczekiwaną postacią tylko dla wąskiego zakresu ściśle określonych systemów, na przykład gdy rozkład przeszkód jest fraktalny . Niemniej jednak prawo potęgowe może być użytecznym przybliżeniem dla szerszego zakresu systemów.

Funkcja autokorelacji FCS dla anomalnej dyfuzji to:

${\ Displaystyle G (\ tau )=G(0){\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D})^{\alpha})(1+a^{-2}(\tau /\tau _{ D})^{\alpha })^{1/2}}}+G(\infty ),}$

gdzie anomalny wykładnik $powyżej$ i staje się wolnym parametrem w dopasowaniu.

Za pomocą FCS wykazano, że anomalny wykładnik jest wskaźnikiem stopnia stłoczenia molekularnego (jest mniejszy niż jeden i mniejszy dla większych stopni stłoczenia).

Dyfuzja polidyspersyjna

Jeśli istnieją cząstki dyfundujące o różnych rozmiarach (współczynnikach dyfuzji), powszechne jest dopasowanie do funkcji będącej sumą form pojedynczych składowych:

${\ Displaystyle \ G(\tau )=G(0)\sum _{i}{\frac {\alpha _{i}}{(1+(\tau /\tau _{D,i}))(1+a ^{-2}(\tau /\tau _{D,i}))^{1/2}}}+G(\infty)}$

gdzie suma jest większa od liczby różnych rozmiarów cząstek, indeksowanych przez i, a $kwantową$ i stężeniem każdego typu. Wprowadza to nowe parametry, co utrudnia dopasowanie, ponieważ trzeba przeszukiwać przestrzeń o wyższych wymiarach. Nieliniowe dopasowanie najmniejszych kwadratów zwykle staje się niestabilne nawet przy niewielkiej liczbie s. ${\ displaystyle \ tau _ {D, i}}$ s. Bardziej niezawodnym schematem dopasowania, szczególnie przydatnym w przypadku próbek polidyspersyjnych, jest metoda maksymalnej entropii.

Dyfuzja z przepływem

Przy dyfuzji wraz z równomiernym przepływem z prędkością w kierunku poprzecznym autokorelacja jest następująca: ${\ displaystyle v}$

${\ Displaystyle \ sol (\ tau) = G (0) {\ Frac {1} {(1 + (\ tau / \ tau _ {D})) (1+ a^{-2}(\tau /\tau _{D}))^{1/2}}}\times \exp[-(\tau /\tau _{v})^{2}\times { \frac {1}{1+\tau /\tau _{D}}}]+G(\infty )}$

gdzie $występuje$ średni czas przebywania, jeśli

Relaksacja chemiczna

Szeroka gama możliwych eksperymentów FCS obejmuje reakcje chemiczne, które nieustannie oscylują od równowagi z powodu ruchów termicznych (a następnie „relaksują się”). W przeciwieństwie do dyfuzji, która jest również procesem relaksacji, fluktuacje powodują zmiany między stanami o różnych energiach. Jednym z bardzo prostych systemów pokazujących relaksację chemiczną byłoby stacjonarne miejsce wiązania w objętości pomiarowej, gdzie cząstki wytwarzają sygnał tylko wtedy, gdy są związane (np. przez FRET lub jeśli czas dyfuzji jest znacznie krótszy niż interwał próbkowania). W tym przypadku autokorelacja to:

${\ Displaystyle \ G (\ tau) = G (0) \ exp (- \ tau / \ tau _ {B}) +G(\infty)}$

Gdzie

${\ Displaystyle \ \ tau _ {B} = (k _ {\ tekst {na}} + k _ {\ tekst {off}}) ^ {- 1}}$

jest czasem relaksacji i zależy od kinetyki reakcji (szybkości włączania i wyłączania) oraz:

${\ Displaystyle G (0) = {\ Frac {1} {\ langle N \ rangle}}} {\ Frac {k_ {na }}{k_{off}}}={\frac {1}{\langle N\rangle }}K}$

jest powiązany ze stałą równowagi K .

Większość systemów z relaksacją chemiczną również wykazuje mierzalną dyfuzję, a funkcja autokorelacji będzie zależała od szczegółów systemu. Jeśli dyfuzja i reakcja chemiczna są oddzielone, połączona autokorelacja jest iloczynem autokorelacji chemicznej i dyfuzyjnej.

Korekta stanu trypletu

Powyższe autokorelacje zakładają, że fluktuacje nie są spowodowane zmianami właściwości fluorescencyjnych cząstek. Jednak w przypadku większości (bio)organicznych fluoroforów – np. zielonego białka fluorescencyjnego , rodaminy, barwników Cy3 i Alexa Fluor – pewna frakcja oświetlonych cząstek jest wzbudzana do stanu trypletowego (lub innych niepromieniujących stanów rozpadu), a następnie nie emituje fotony dla charakterystycznego czasu relaksacji ${\ displaystyle \ tau _ {F}}$ . Zwykle $,$ , co jest zwykle mniejsze niż dynamika będąca przedmiotem zainteresowania (np. ) ale wystarczająco duże, aby można je było zmierzyć τ $\ displaystyle \ tau _ {F}}$ . Termin multiplikatywny jest dodawany do autokorelacji, aby uwzględnić stan trypletu. Dla normalnej dyfuzji:

${\ Displaystyle \ sol (\ tau) = G (0) {\ Frac {(1-F + Fe ^ {- \ tau / \ tau _ {F}}) }{(1-F)}}{\frac {1}{(1+(\tau /\tau _{D,i}))(1+a^{-2}(\tau /\tau _{ D,i}))^{1/2}}}+G(\infty)}$

gdzie $jest ułamkiem$$.$ , które weszły w stan trypletowy i czasem relaksacji stanu trypletowego Jeśli interesująca dynamika jest znacznie wolniejsza niż relaksacja stanu trypletu, składnik autokorelacji o krótkim czasie można po prostu skrócić, a składnik trypletu jest niepotrzebny.

Wspólne sondy fluorescencyjne

Gatunkiem fluorescencyjnym używanym w FCS jest zazwyczaj interesująca biocząsteczka, która została oznaczona fluoroforem ( na przykład przy użyciu immunohistochemii ) lub jest nagim fluoroforem, który jest używany do sondowania pewnego środowiska będącego przedmiotem zainteresowania (np. cytoszkieletu komórki). Poniższa tabela przedstawia współczynniki dyfuzji niektórych powszechnych fluoroforów w wodzie w temperaturze pokojowej oraz długości fal ich wzbudzenia.

Barwnik fluorescencyjny	${\ Displaystyle \ D}$ [10-10 m 2 s - 1 ]	T [°C]	wzbudzenia [nm]	Odniesienie
Rodamina 6G	2,8, 3,0, 4,14 ± 0,05, 4,20 ± 0,06	25	514
Rodamina 110	2.7		488
Tetrametylorodamina	2.6		543
Cy3	2.8		543
Cy5	2,5, 3,7 ± 0,15	25	633
karboksyfluoresceina	3.2		488
Aleksa 488	1,96, 4,35	22,5±0,5	488
Atto 655-maleimid	4,07 ± 0,1	25	663
Kwas Atto 655-karboksylowy	4,26 ± 0,08	25	663
2′, 7′-difluorofluoresceina (Oregon Green 488)	4,11 ± 0,06	25	498

Odmiany FCS

FCS prawie zawsze odnosi się do pojedynczego punktu, pojedynczego kanału, czasowego pomiaru autokorelacji, chociaż termin „spektroskopia korelacji fluorescencji” z historycznego kontekstu naukowego nie implikuje takiego ograniczenia. FCS został rozszerzony w wielu odmianach przez różnych badaczy, przy czym każde rozszerzenie generuje inną nazwę (zwykle akronim).

Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności punktowej (svFCS)

Podczas gdy FCS jest pomiarem punktowym zapewniającym czas dyfuzji przy danej objętości obserwowanej, svFCS jest techniką, w której plamka obserwacyjna jest zróżnicowana w celu pomiaru czasów dyfuzji przy różnych rozmiarach plamki. Zależność między czasem dyfuzji a obszarem plamki jest liniowa i można ją wykreślić w celu rozszyfrowania głównego wkładu uwięzienia. Powstała krzywa nazywana jest prawem dyfuzji. Ta technika jest używana w biologii do badania organizacji błony komórkowej żywych komórek.

${\ Displaystyle \ \ omega _ {xy} ^ {2} = 4D \ tau _ {D} + t_ {0}}$

gdzie jest punktem przecięcia osi y. ${\ displaystyle t_ {0}}$ W przypadku dyfuzji Browna ${\ displaystyle t_ {0}=0}$ . W przypadku ograniczenia z powodu izolowanych domen, $t_{0}<0$ gdy w przypadku domen izolowanych, $t_{0}>0$.

Badania svFCS na żywych komórkach i dokumentach symulacyjnych

Fluorescencyjna spektroskopia korelacyjna z kontrolowaną objętością pobierania próbek (SVC-FCS):

z-scan FCS

FCS z nano-aperturami: przełamanie bariery dyfrakcyjnej

STED-FCS:

Fluorescencyjna spektroskopia korelacji krzyżowej ( FCCS )

FCS jest czasami używany do badania interakcji molekularnych z wykorzystaniem różnic w czasach dyfuzji (np. produkt reakcji asocjacji będzie większy, a zatem będzie miał dłuższe czasy dyfuzji niż poszczególne reagenty); jednakże FCS jest stosunkowo niewrażliwy na masę cząsteczkową, jak widać z następującego równania odnoszącego masę cząsteczkową do czasu dyfuzji cząstek kulistych (np. białek):

${\ Displaystyle \ \ tau _ {D} = {\ Frac {3 \ pi \ omega _ {xy} ^ {2} \ eta} {2kT}}(M)^{1/3}}$

gdzie $jest$$próbki$ i jest masą cząsteczkową substancji fluorescencyjnych W praktyce czasy dyfuzji muszą być wystarczająco różne — współczynnik co najmniej 1,6 — co oznacza, że ​​masy cząsteczkowe muszą różnić się współczynnikiem 4. Spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji dwukolorowej (FCCS) mierzy interakcje poprzez korelację krzyżową dwóch lub więcej kanałów fluorescencyjnych (jeden kanał dla każdego reagenta), co rozróżnia interakcje z większą czułością niż FCS, zwłaszcza gdy zmiana masy w reakcji jest niewielka.

Metody analizy jasności

Ten zestaw metod obejmuje liczbę i jasność (N&B), histogram zliczania fotonów (PCH), analizę rozkładu intensywności fluorescencji (FIDA) i analizę kumulacyjną. oraz analiza rozkładu intensywności przestrzennej. Opisano również kombinację wielu metod. Spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji przezwycięża słabą zależność szybkości dyfuzji od masy cząsteczkowej, patrząc na zbieżność wielokolorową. A co z homointerakcjami? Rozwiązanie leży w analizie jasności. Metody te wykorzystują niejednorodność rozkładu intensywności fluorescencji do pomiaru jasności molekularnej różnych gatunków w próbce. Ponieważ dimery będą zawierały dwa razy więcej znaczników fluorescencyjnych niż monomery, ich jasność molekularna będzie w przybliżeniu dwukrotnie większa niż w przypadku monomerów. W rezultacie względna jasność jest czułą miarą oligomeryzacji. Średnia jasność molekularna ( $langle I\rangle }$ z wariancją ( ${$$ja$ średnią intensywnością ( $displaystyle$ ) w następujący sposób:

${\ Displaystyle \ \ langle \ varepsilon \ rangle = {\ Frac {\ sigma ^ {2} - \ langle I \ rangle} {\ langle I\rangle }}=\suma _{i}f_{i}\varepsilon _{i}}$

Tutaj $i$${$ intensywnością ułamkową i jasnością cząsteczkową gatunków. fa $displaystyle f_$ } }

FRET-FCS

Inne podejście oparte na FCS do badania interakcji molekularnych wykorzystuje transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) zamiast fluorescencji i nosi nazwę FRET-FCS. W przypadku FRET istnieją dwa rodzaje sond, podobnie jak w przypadku FCCS; jest jednak tylko jeden kanał, a światło jest wykrywane tylko wtedy, gdy dwie sondy są bardzo blisko — wystarczająco blisko, aby zapewnić interakcję. Sygnał FRET jest słabszy niż w przypadku fluorescencji, ale ma tę zaletę, że jest tylko sygnał podczas reakcji (oprócz autofluorescencji ).

Skanowanie FCS

W skaningowej spektroskopii korelacji fluorescencji (sFCS) mierzona objętość jest przesuwana po próbce w określony sposób. Wprowadzenie skanowania jest motywowane jego zdolnością do złagodzenia lub usunięcia kilku odrębnych problemów często spotykanych w standardowym FCS, a tym samym poszerzenia zakresu stosowalności metod korelacji fluorescencji w układach biologicznych.

Niektóre odmiany FCS mają zastosowanie tylko do szeregowych skaningowych mikroskopów laserowych. Spektroskopia korelacji obrazu i jej odmiany zostały zaimplementowane na skaningowym mikroskopie konfokalnym lub skaningowym mikroskopie dwufotonowym, ale przeniesiono je do innych mikroskopów, takich jak mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem. Raster ICS (RICS) i pozycyjny FCS (PSFCS) uwzględniają w analizie opóźnienie czasowe między częściami skanu obrazu. Ponadto skany niskowymiarowe (np. okrągły pierścień) — możliwe tylko w systemie skanującym — mogą uzyskiwać dostęp do skal czasowych między pojedynczym punktem a pomiarami pełnego obrazu. Ścieżka skanowania została również stworzona, aby adaptacyjnie podążać za cząsteczkami.

Wirujący dysk FCS i mapowanie przestrzenne

Każdą z metod spektroskopii korelacji obrazu można również przeprowadzić na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem, który w praktyce pozwala uzyskać większe prędkości obrazowania w porównaniu do laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Podejście to zostało niedawno zastosowane do dyfuzji w zróżnicowanym przestrzennie złożonym środowisku, tworząc mapę współczynnika dyfuzji w rozdzielczości pikseli. Przestrzenne mapowanie dyfuzji za pomocą FCS zostało następnie rozszerzone na system TIRF. Przestrzenne mapowanie dynamiki za pomocą technik korelacji było stosowane wcześniej, ale tylko w rzadkich punktach lub przy zgrubnej rozdzielczości.

Spektroskopia korelacji obrazu (ICS)

Kiedy ruch jest powolny (w biologii, na przykład dyfuzja w błonie), uzyskanie odpowiednich statystyk z jednopunktowego eksperymentu FCS może zająć zbyt dużo czasu. Więcej danych można uzyskać przeprowadzając eksperyment w wielu punktach przestrzennych równolegle, przy użyciu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Podejście to nazwano spektroskopią korelacji obrazu (ICS). Pomiary można następnie uśrednić razem.

Inna odmiana ICS wykonuje przestrzenną autokorelację na obrazach, która dostarcza informacji o stężeniu cząstek. Korelacja jest następnie uśredniana w czasie. Podczas gdy biały szum kamery nie koreluje autokorelacji w czasie, robi to w przestrzeni - tworzy to amplitudę białego szumu w przestrzennej funkcji autokorelacji, którą należy uwzględnić przy dopasowywaniu amplitudy autokorelacji w celu znalezienia stężenia cząsteczek fluorescencyjnych.

Naturalnym rozszerzeniem wersji korelacji czasowej i przestrzennej jest czasoprzestrzenna ICS (STICS). W STICS nie ma wyraźnego uśredniania w przestrzeni ani w czasie (jedynie uśrednianie właściwe dla korelacji). W systemach z ruchem nieizotropowym (np. ukierunkowany przepływ, asymetryczna dyfuzja) STICS może wyodrębnić informacje kierunkowe. Odmianą blisko spokrewnioną ze STICS (przez transformatę Fouriera) jest k -space Image Correlation Spectroscopy (kICS).

Istnieją również wersje ICS z korelacją krzyżową, które mogą dawać stężenie, dystrybucję i dynamikę kolokalizowanych cząsteczek fluorescencyjnych. Cząsteczki są uważane za kolokalizowane, gdy poszczególne wkłady fluorescencji są nie do odróżnienia z powodu nakładających się funkcji rozproszenia punktowego intensywności fluorescencji.

Spektroskopia korelacji obrazu cząstek (PICS)

PICS to potężne narzędzie analityczne, które rozwiązuje korelacje na długości nanometrów i milisekundowej skali czasu. Zaadaptowany z metod czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu, wykorzystuje wysoką dokładność pozycjonowania śledzenia pojedynczych cząstek. Podczas gdy konwencjonalne metody śledzenia zawodzą, jeśli przecinają się trajektorie wielu cząstek, metoda ta zasadniczo sprawdza się w przypadku dowolnie dużych gęstości cząsteczek i parametrów dynamicznych (np. współczynników dyfuzji, prędkości), o ile można zidentyfikować poszczególne cząsteczki. Jest tani i solidny obliczeniowo oraz pozwala na identyfikację i ilościowe określenie ruchów (np. dyfuzji, transportu aktywnego, dyfuzji ograniczonej) w zespole cząstek, bez żadnej wiedzy a priori o dynamice.

Rozszerzenie spektroskopii korelacji krzyżowej obrazu cząstek (PICCS) jest dostępne dla procesów biologicznych, które obejmują wielu partnerów interakcji, co można zaobserwować za pomocą mikroskopii dwukolorowej.

FCS obrazowanie fluktuacji optycznych w super rozdzielczości (fcsSOFI)

Obrazowanie fluktuacji optycznych w super rozdzielczości (SOFI) to technika super rozdzielczości, która pozwala uzyskać rozdzielczości przestrzenne poniżej granicy dyfrakcji na podstawie analizy przetwarzania końcowego z równaniami korelacji, podobnie jak FCS. Podczas gdy oryginalne raporty SOFI wykorzystywały fluktuacje ze stacjonarnych, mrugających fluoroforów, FCS połączono z SOFI, gdzie fluktuacje są wytwarzane z sond dyfuzyjnych w celu stworzenia przestrzennych map współczynników dyfuzji o super rozdzielczości. Zostało to zastosowane do zrozumienia właściwości dyfuzyjnych i przestrzennych materiałów porowatych i ograniczonych. Obejmuje to hydrożele agarozowe i reagujące na temperaturę PNIPAM, ciekłe kryształy i polimery z rozdziałem faz oraz kondensaty RNA/białka.

Całkowite wewnętrzne odbicie FCS

Fluorescencja całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) to podejście mikroskopowe, które jest czułe tylko na cienką warstwę w pobliżu powierzchni szkiełka nakrywkowego, co znacznie minimalizuje fluorescencję tła. FCS został rozszerzony na ten typ mikroskopu i nosi nazwę TIR-FCS. Ponieważ intensywność fluorescencji w TIRF spada wykładniczo wraz z odległością od szkiełka nakrywkowego (zamiast Gaussa z konfokalnością), funkcja autokorelacji jest inna.

Obrazowanie FCS przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z lekkim arkuszem

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem lub mikroskopia obrazowania w płaszczyźnie selektywnej (SPIM) wykorzystuje oświetlenie, które jest wykonywane prostopadle do kierunku obserwacji, za pomocą cienkiej warstwy światła (laserowego). W pewnych warunkach tę zasadę oświetlenia można połączyć ze spektroskopią korelacji fluorescencji, aby umożliwić przestrzenne obrazowanie ruchliwości i interakcji cząstek fluorescencyjnych, takich jak białka znakowane GFP, wewnątrz żywych próbek biologicznych.

Inne dynamiczne podejścia fluorescencyjne

Istnieją dwie główne niekorelacyjne alternatywy dla FCS, które są szeroko stosowane do badania dynamiki gatunków fluorescencyjnych.

Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)

W FRAP region jest krótko wystawiony na intensywne światło, nieodwracalnie fotowybielające fluorofory, i obrazuje się powrót fluorescencji w wyniku dyfuzji pobliskich (niewybielonych) fluoroforów. Podstawową przewagą FRAP nad FCS jest łatwość interpretacji jakościowych eksperymentów typowych dla biologii komórki. Różnice między liniami komórkowymi lub regionami komórki lub przed i po podaniu leku często można scharakteryzować za pomocą prostego przeglądu filmów. Eksperymenty FCS wymagają pewnego poziomu przetwarzania i są bardziej wrażliwe na potencjalnie zakłócające wpływy, takie jak: dyfuzja rotacyjna, wibracje, fotowybielanie, zależność od oświetlenia i koloru fluorescencji, nieodpowiednie statystyki itp. Znacznie łatwiej jest zmienić objętość pomiaru we FRAP, co pozwala większa kontrola. W praktyce wolumeny są zwykle większe niż w FCS. Podczas gdy eksperymenty FRAP są zazwyczaj bardziej jakościowe, niektórzy badacze badają FRAP ilościowo i obejmują dynamikę wiązania. Wadą FRAP w biologii komórki jest wolnorodnikowe zaburzenie komórki spowodowane fotowybielaniem. Jest również mniej wszechstronny, ponieważ nie może mierzyć koncentracji, dyfuzji rotacyjnej ani kolokalizacji. FRAP wymaga znacznie wyższego stężenia fluoroforów niż FCS.

Śledzenie cząstek

W śledzeniu cząstek trajektorie zestawu cząstek są mierzone, zwykle poprzez zastosowanie algorytmów śledzenia cząstek do filmów. [1] Śledzenie cząstek ma tę zaletę, że wszystkie informacje dynamiczne są zachowywane w pomiarze, w przeciwieństwie do FCS, gdzie korelacja uśrednia dynamikę do pojedynczej gładkiej krzywej. Zaleta jest widoczna w systemach wykazujących złożoną dyfuzję, w których bezpośrednie obliczenie średniego kwadratu przemieszczenia umożliwia bezpośrednie porównanie z dyfuzją normalną lub potęgową. Aby zastosować śledzenie cząstek, cząstki muszą być rozróżnialne, a zatem w stężeniu niższym niż wymagane przez FCS. Ponadto śledzenie cząstek jest bardziej wrażliwe na szum, który czasami może wpłynąć na wyniki w nieprzewidywalny sposób.

Spektroskopia korelacji autofluorescencji

Niedawny postęp w nanofotonice ultrafioletowej doprowadził do opracowania badań nad pojedynczymi cząsteczkami białek bez znaczników poprzez wzbudzanie ich światłem głębokiego ultrafioletu i badanie procesów dynamicznych.

Dwu- i trójfotonowe wzbudzenie FCS

Kilka zalet zarówno w rozdzielczości przestrzennej, jak i minimalizacji fotouszkodzeń / fotowybielania w próbkach organicznych i / lub biologicznych uzyskuje się za pomocą FCS wzbudzenia dwufotonowego lub trójfotonowego.

Zobacz też

• Mikroskopia konfokalna
• Fluorescencyjna spektroskopia korelacji krzyżowej (FCCS)
• Rezonansowy transfer energii Förstera (FRET)
• Dynamiczne rozpraszanie światła
• Współczynnik dyfuzji

Dalsza lektura

• Rigler R. i Widengren J. (1990). Ultraczułe wykrywanie pojedynczych cząsteczek za pomocą fluorescencyjnej spektroskopii korelacyjnej, BioScience (red. Klinge & Owman) str. 180
•    Oehlenschläger, F.; Schwille, P.; Eigen, M. (1996). „Wykrywanie RNA HIV-1 za pomocą amplifikacji opartej na sekwencji kwasu nukleinowego połączonej ze spektroskopią korelacji fluorescencyjnej” . proc. Natl. Acad. nauka USA . 93 (23): 12811–12816. Bibcode : 1996PNAS...9312811O . doi : 10.1073/pnas.93.23.12811 . PMC24002 . _ PMID 8917501 .

Linki zewnętrzne

•   Haustein, Elke; Schwille, Petra (2004). „Metody spektroskopowe pojedynczych cząsteczek”. Aktualna opinia w biologii strukturalnej . 14 (5): 531–540. doi : 10.1016/j.sbi.2004.09.004 . hdl : 11858/00-001M-0000-0029-D76C-C . PMID 15465312 .
• Sala lekcyjna FCS
• Samouczek Stowers Institute FCS
• Samouczek FCS konsorcjum migracji komórek
• Spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) (Becker & Hickl GmbH, strona internetowa)