Cyjanina

Nie mylić z cyjankiem .

Cyjaniny, określane również jako tetrametyloindo(di)-karbocyjaniny, to syntetyczna rodzina barwników należąca do grupy polimetin . Chociaż nazwa wywodzi się etymologicznie od terminów określających odcienie niebieskiego , rodzina cyjanin obejmuje widmo elektromagnetyczne od bliskiej podczerwieni do UV .

Chemicznie cyjaniny są układem sprzężonym między dwoma atomami azotu ; w każdej strukturze rezonansowej dokładnie jeden atom azotu jest utleniany do iminu . Zazwyczaj tworzą one część azotowego układu heterocyklicznego .

Głównym zastosowaniem barwników cyjaninowych jest znakowanie biologiczne . Niemniej jednak istnieje obszerna literatura dotycząca zarówno ich syntezy, jak i zastosowań, a cyjanki są powszechne w niektórych CD i DVD .

Struktura

Cyjaniny: I = streptocyjaniny, II = hemicyjaniny, III = zamknięte cyjaniny

Cyjaniny zostały sklasyfikowane na wiele sposobów:

• Streptocyjaniny lub cyjaniny o otwartym łańcuchu :

R ₂ N ⁺ =CH[CH=CH] _n -NR ₂ (I)

• Hemicyjaniny :

Aryl=N ⁺ =CH[CH=CH] _n -NR ₂ (II)

• Cyjaniny o zamkniętym łańcuchu :

Aryl= N ⁺ =CH[CH=CH] _n -N=aryl (III)

Dodatkowo klasy te są uznawane:

• Neutrocyjaniny :

_, R2N ⁺ =CH[CH=CH] _n -CN i R2N ₊ ⁼ CH[CH=CH] _n - CHO tym

• Merocyjaniny w spiropirany i chinoftalony .

• Apocyjaniny

gdzie dwa czwartorzędowe atomy azotu są połączone łańcuchem polimetinowym . Obydwa atomy azotu mogą niezależnie stanowić część ugrupowania heteroaromatycznego , takiego jak pirol , imidazol , tiazol , pirydyna , chinolina , indol , benzotiazol itp.

Historia i zastosowanie w przemyśle

Cyjaniny zostały po raz pierwszy zsyntetyzowane ponad sto lat temu. Były pierwotnie używane i nadal są używane do zwiększania zakresu czułości emulsji fotograficznych , tj. do zwiększania zakresu długości fal , które będą tworzyć obraz na kliszy, czyniąc kliszę panchromatyczną . Cyjaniny są również używane w CD-R i DVD-R . Stosowane są głównie w kolorze zielonym lub jasnoniebieskim i są niestabilne chemicznie. Z tego powodu niestabilizowane dyski cyjaninowe nie nadają się do archiwalnych płyt CD i DVD. Najnowsze dyski cyjaninowe zawierają stabilizatory, zwykle atom metalu związany z cząsteczką cyjaniny, które znacznie spowalniają degradację. Dyski te są często oceniane jako archiwalne na 75 lat lub więcej. Inne barwniki stosowane w płytach CD-R to ftalocyjanina i az .

Zastosowanie w biotechnologii

Do zastosowań w biotechnologii specjalne barwniki cyjaninowe są syntetyzowane ze struktur 2, 3, 5 lub 7-metynowych z grupami reaktywnymi na jednym lub obu końcach azotu, dzięki czemu można je chemicznie łączyć z kwasami nukleinowymi lub cząsteczkami białek . Etykietowanie odbywa się w celach wizualizacji i oceny ilościowej. Zastosowania biologiczne obejmują porównawczą hybrydyzację genomową i chipy genowe , które są wykorzystywane w transkryptomice , oraz różne badania w proteomice , takie jak lokalizacja RNA, badania interakcji molekularnych za pomocą transferu energii rezonansu fluorescencji ( FRET ) i fluorescencyjne testy immunologiczne .

Dostępne są barwniki cyjaninowe z różnymi modyfikacjami, takimi jak podstawniki metylowe, etylowe lub butylowe, grupy karboksylowe, acetylometoksylowe i sulfo, które zmieniają ich hydrofilowość.

Sonda	Ex (nm)	Em (nm)	MW	Wydajność kwantowa
Cy2	489	506	714	QY 0,12
Cy3	(512);550	570;(615)	767	QY 0,15 *
Cy3B	558	572;(620)	658	QY 0,67
Cy3.5	581	594;(640)	1102	QY 0,15
Cy5	(625);650	670	792	QY 0,27
Cy5.5	675	694	1128	QY 0,28
Cy7	743	767	818	QY 0,28

Ex (nm): długość fali wzbudzenia w nanometrach Em (nm): długość fali emisji w nanometrach MW: masa cząsteczkowa QY: wydajność kwantowa

* Zależy silnie od lepkości, temperatury i interakcji biomolekularnych.

Typowe barwniki cyjaninowe i ich zastosowania

Ponieważ dają jaśniejszą i bardziej stabilną fluorescencję, cyjanki mogą korzystnie zastąpić konwencjonalne barwniki, takie jak fluoresceina i rodaminy .

• Najbardziej popularne są Cy3 i Cy5, zwykle używane razem do wykrywania 2 kolorów.

Cy3 fluoryzuje zielonkawo-żółty (wzbudzenie ~ 550 nm , emisja ~ 570 nm), podczas gdy Cy5 fluoryzuje w obszarze dalekiej czerwieni (wzbudzenie ~ 650, emisja 670 nm). Cy3 można wykryć za pomocą różnych fluorometrów, aparatów do obrazowania i mikroskopów ze standardowymi filtrami dla tetrametylorodaminy (TRITC). Ze względu na wysoki molowy współczynnik ekstynkcji barwnik ten jest również łatwo wykrywalny gołym okiem na żelach do elektroforezy oraz w roztworze. Cy5 stał się popularnym zamiennikiem dalekiej czerwieni barwników fluorescencyjnych ze względu na wysoki współczynnik ekstynkcji (tak mały jak 1 nanomol można wykryć w elektroforezie żelowej gołym okiem) i maksymalną emisję fluoroforu w obszarze czerwonym, gdzie wiele detektorów CCD ma maksymalną czułość i obiekty biologiczne dają niskie zakłócenia tła.

Skanery faktycznie wykorzystują różne długości fal emisji lasera (zwykle 532 nm i 635 nm ) oraz długości fal filtrów (550-600 nm i 655-695 nm ), aby uniknąć zanieczyszczenia tła. W ten sposób są w stanie łatwo odróżnić kolory od Cy3 i od Cy5, a także są w stanie ilościowo określić ilość znakowania Cy3 i Cy5 w jednej próbce (wykrywanie wieloparametryczne).

• Przydatne są inne barwniki cyjaninowe:

Cy3.5 może zastąpić sulforodaminę 101.

Cy5.5 jest barwnikiem emitującym fluorescencję w bliskiej podczerwieni (IR) (maks. wzbudzenie/emisja 678/694 nm).

Cy7 to fluor bliskiej podczerwieni, który jest niewidoczny gołym okiem (maks. wzbudzenie/emisja 750/776 nm). Jest używany w in vivo , a także jako barwnik Cy7.5.

sulfo -cyjaninowe zawierają jedną lub dwie grupy sulfo, dzięki czemu barwnik Cy jest rozpuszczalny w wodzie, ale dostępne są formy tri- i quadri-sulfonowane, które zapewniają jeszcze wyższą rozpuszczalność w wodzie. PEGylacja to kolejna modyfikacja, która nadaje hydrofilowość nie tylko barwnikowi, ale także znakowanemu koniugatowi.

Nomenklatura i struktura

Nazewnictwo Cy3 i Cy5 zostało po raz pierwszy zaproponowane przez Ernsta i in. w 1989 roku i jest niestandardowy, ponieważ nie daje żadnych wskazówek na temat ich struktury chemicznej. W oryginalnym artykule liczba oznaczała liczbę metin ( jak pokazano), a łańcuchy boczne nie zostały określone. Z powodu tej niejednoznaczności w literaturze różne struktury są określane jako Cy3 i Cy5. Grupy R nie muszą być identyczne. W stosowanych barwnikach są to krótkie alifatyczne , z których jeden lub oba kończą się wysoce reaktywnym ugrupowaniem , takim jak N-hydroksysukcynoimid lub maleimid .

Alternatywy

Opracowano wiele analogów standardowych barwników Cy 2 / 3 / 3,5 / 5 / 5,5 / 7 / 7,5, stosując różne modyfikacje: barwniki Alexa Fluor , Dylight , barwniki FluoProbes , barwniki Sulfo Cy, barwniki Seta, barwniki IRIS firmy Cyanine Technologies i inne mogą być używane zamiennie z barwnikami Cy w większości zastosowań biochemicznych, z deklarowaną poprawą rozpuszczalności, fluorescencji lub fotostabilności.

Chociaż ochrona patentowa dla standardowej serii barwników Cy wygasła, zastrzeżone nazewnictwo Cy pozostaje na swoim miejscu. W związku z tym obecnie sprzedawane są barwniki, które są identyczne z barwnikami Cy, ale mają inne nazwy.

Aplikacje

Cyjanobakteria zabarwiona na zielono barwnikiem cyjaninowym

Barwniki cyjaninowe są używane do znakowania białek, przeciwciał, peptydów, sond kwasów nukleinowych i wszelkiego rodzaju innych biomolekuł stosowanych w różnych technikach wykrywania fluorescencji: cytometria przepływowa, mikroskopia (głównie zakres widzialny , ale także UV , IR ), mikropłytki testy, mikromacierze , a także „świetlne sondy” i obrazowanie in vivo.

Znakowanie kwasów nukleinowych

W eksperymentach z mikromacierzami DNA lub RNA jest znakowane Cy3 lub Cy5, które zostały zsyntetyzowane w celu przeniesienia grupy reaktywnej estru N-hydroksysukcynimidylu (estru NHS ). Ponieważ estry NHS łatwo reagują tylko z alifatycznymi grupami aminowymi , których brakuje w kwasach nukleinowych, nukleotydy muszą być modyfikowane grupami aminoallilowymi . Odbywa się to poprzez włączanie nukleotydów zmodyfikowanych aminoallilem podczas reakcji syntezy. Dobrym stosunkiem jest etykieta co 60 zasad, tak aby etykiety nie były zbyt blisko siebie, co skutkowałoby efektem gaszenia .

Znakowanie białek

W przypadku znakowania białek barwniki Cy3 i Cy5 czasami zawierają grupę sukcynoimidylową , która reaguje z aminami, lub grupę maleimidową , która reaguje z grupą sulfhydrylową reszt cysteiny .

Cy5 jest wrażliwy na swoje elektroniczne środowisko. Zmiany w konformacji białka, do którego jest przyłączone, spowodują wzmocnienie lub wygaszenie emisji. Szybkość tej zmiany można zmierzyć w celu określenia parametrów kinetycznych enzymu. Barwniki mogą być używane do podobnych celów w FRET .

Cy3 i Cy5 są używane w eksperymentach proteomicznych , dzięki czemu próbki z dwóch źródeł można mieszać i przepuszczać razem przez proces rozdzielania. Eliminuje to różnice wynikające z różnych warunków eksperymentalnych, które są nieuniknione, jeśli próbki były analizowane oddzielnie. Te różnice sprawiają, że użycie komputerów do automatyzacji pozyskiwania danych po zakończeniu separacji jest niezwykle trudne, jeśli nie niemożliwe. Używanie tych barwników sprawia, że ​​automatyzacja jest banalna.

Etymologia

Słowo cyjanina pochodzi od angielskiego słowa „cyan”, które konwencjonalnie oznacza odcień niebiesko-zielonego (zbliżony do „aqua”) i pochodzi od greckiego κυάνεος / κυανοῦς kyaneos/kyanous , co oznacza nieco inny kolor: „ciemnoniebieski ".