Fotoreaktywny analog aminokwasu

Fotoreaktywne analogi aminokwasów to sztuczne analogi naturalnych aminokwasów, które można wykorzystać do sieciowania kompleksów białkowych. Fotoreaktywne analogi aminokwasów można włączać do białek i peptydów in vivo lub in vitro . Powszechnie stosowanymi fotoreaktywnymi analogami aminokwasów są fotoreaktywne analogi diazyryny do leucyny i metioniny oraz para -benzoilofenyloalaniny. Po ekspozycji na światło ultrafioletowe , są aktywowane i kowalencyjnie wiążą się z oddziałującymi białkami, które znajdują się w odległości kilku angstremów od fotoreaktywnego analogu aminokwasu.

L -foto-leucyna i L -foto-metionina są analogami naturalnie występujących aminokwasów L - leucyny i L - metioniny , które są endogennie włączane do pierwotnej sekwencji białek podczas syntezy przy użyciu normalnej maszynerii translacji. Są one następnie aktywowane światłem ultrafioletowym (UV) w celu kowalencyjnego sieciowania białek w domenach interakcji białko-białko w ich natywnym in vivo środowisko. Metoda umożliwia określenie i scharakteryzowanie zarówno stabilnych, jak i przejściowych oddziaływań białek w komórkach bez dodatku chemicznych środków sieciujących i związanych z nimi rozpuszczalników, które mogą niekorzystnie wpływać na biologię komórki badanej w eksperymencie.

W połączeniu z pożywkami ograniczającymi, pozbawionymi leucyny i metioniny, fotoaktywowane pochodne są traktowane jak naturalnie występujące aminokwasy przez komórkową maszynerię syntezy białek . Dzięki temu mogą zastępować leucynę lub metioninę w pierwszorzędowej strukturze białek. Pochodne fotoleucyny i foto-metioniny zawierają pierścienie diazyrynowe, które są aktywowane pod wpływem światła UV, stając się reaktywnymi półproduktami, które tworzą wiązania kowalencyjne z pobliskimi łańcuchami bocznymi i szkieletami białek. Naturalnie oddziałujące białka w komórce mogą zostać natychmiast uwięzione przez fotoaktywację białek zawierających diazyrynę w hodowanych komórkach. Usieciowane kompleksy białkowe można wykrywać przez zmniejszenie ruchliwości na SDS-PAGE, a następnie metodą Western blotting , chromatografię wykluczania , sedymentację w gradiencie gęstości sacharozy lub spektrometrię mas .

• Vila-Perello, M. i in. (2007). Kowalencyjne wychwytywanie zależnej od fosforu oligomeryzacji białek przez specyficzne dla miejsca włączenie foto-sieciującego diazyryny. J. Am. chemia Soc., 129(26):8068-69.
• Bomgarden, R. (2008). Badanie interakcji białek w żywych komórkach. gen. inż. Aktualności. Tom. 28, nr 7. [1]
• P.-O. Hetu i in. (2008) Fotosieciowanie białek w nienaruszonych komórkach ujawnia dimeryczną strukturę cyklooksygenazy-2 i wrażliwą na inhibitor strukturę oligomeryczną mikrosomalnej syntazy prostaglandyny E2-1. Łuk. Biochem. Biofiza. doi : 10.1016/j.abb.2008.04.038
• Weaver, MS i in. (2008) Wiążąca miedź domena sparc pośredniczy w przeżyciu komórek in vitro poprzez interakcję z integryną beta 1 i aktywację kinazy połączonej z integryną. J. Biol. chemia doi : 10.1074/jbc.M706563200