L-foto-metionina
|
|
| Nazwy | |
|---|---|
|
nazwa IUPAC
( S )-2-amino-4-(3-metylo-3H- diazyryn -3-ylo)butanowy
|
|
| Inne nazwy
L -2-amino-5,5-azi-heksanowy
|
|
| Identyfikatory | |
|
Model 3D ( JSmol )
|
|
| ChemSpider | |
|
Identyfikator klienta PubChem
|
|
|
|
|
|
| Nieruchomości | |
| C6H11N3O2 _ _ _ _ _ _ _ | |
| Masa cząsteczkowa | 157,173 g·mol -1 |
| 6 mg/ml | |
| Zagrożenia | |
| Oznakowanie GHS : | |
| H315 , H319 , H335 | |
| P261 , P305 , P338 , P351 | |
|
O ile nie zaznaczono inaczej, dane podano dla materiałów w stanie normalnym (przy 25°C [77°F], 100 kPa).
|
|
L -foto-metionina jest fotoreaktywną pochodną aminokwasu L -metioniny , która została syntetycznie utworzona w 2005 roku. Białka to długie łańcuchy polimerowe aminokwasów ; które mogą mieć różne struktury i rozmiary. Białka mogą wchodzić ze sobą w interakcje ( interakcje białko-białko lub PPI) i poprzez te interakcje wpływają na interakcje i szlaki komórkowe. Takie interakcje; w fuzji wirusa i sygnalizacji czynnika wzrostu wyglądał obiecująco w przypadku leków przeciwwirusowych lub przeciwnowotworowych, dlatego należy przeprowadzić badania, aby zrozumieć interakcje. Dzięki temu badania zaczęły dowodzić, że białka funkcjonują w kompleksach supramolekularnych w porównaniu do pojedynczych jednostek. Tak więc naukowcy Monika Suchanek, Anna Radzikowski i Christoph Thiele zbadali, że bezpośrednim sposobem lepszego badania tych interakcji w środowisku naturalnym jest stworzenie nowego sposobu fotosieciowania białek; co doprowadziło do syntezy L -foto-metionina iw tym samym badaniu L -foto-leucyna .
Synteza
Racemiczna foto-metionina jest syntetyzowana z 4,4'-azi-pentanalu w syntezie aminokwasów Streckera . Enancjomer L jest rozdzielany przez rozdział enzymatyczny acetamidu.
Fotoaktywacja metioniny
Jak wspomniano wcześniej, L-Photo-Methionine można wykorzystać do badania interakcji białko-białko z białkami w ich naturalnym środowisku. Jak to jest możliwe, to jak aminokwas zachowuje się pod wpływem światła UV. Aby udowodnić, że najpierw synteza działa, dodaje się radioaktywny węgiel ( 14 C) w ramach własnej syntezy w celu przeprowadzenia odpowiednich metod spektroskopowych.
Aktywacja foto-metioniny
Ponieważ poprzednia synteza zadziałała, foto-metionina jest fotoreaktywna ze względu na pierścień diazyrynowy . Kiedy ten pierścień zostanie wystawiony na działanie światła UV, azot opuszcza go jako gazowy azot (N 2 ) i tworzy wysoce reaktywny pośredni karben . Fotoaktywacja aminokwasów zapewnia zdolność fotosieciowania w białkach. Ten rodzaj sieciowania ma trzy główne zalety; istnieje większa specyficzność tego sieciowania ze względu na krótkotrwałe związki pośrednie i to, że ten aminokwas jest funkcjonalny, a co najważniejsze; nietoksyczne (co oznacza, że nie powinno radykalnie zakłócać funkcji lub struktury białka). Badania wykazały, że ta aktywacja jest krokiem ograniczającym szybkość; a nie krzyżowanie.
Nowa wydajna synteza i zastosowanie
Naukowcy Miquel Vila-Perello´, Matthew R. Pratt, Frej Tulin i Tom W. Muir chcieli stworzyć wydajną syntezę, ponieważ oryginał wymagał roztworu enzymatycznego i miał niską wydajność. Zaczęli więc od kwasu L-glutaminowego z grupami ochronnymi zarówno na kwasie karboksylowym (tert-butylowym), jak i Boc na aminie. Ta synteza nie zostanie poddana szczegółom jak klasyka, ale poniżej znajduje się pełna synteza. Aby znaleźć rzeczywiste kroki, zajrzyj do odniesienia.
Tak więc, po zsyntetyzowaniu L-foto-metioniny, wydajność wyniosła 32%, znacznie więcej (sześciokrotnie) niż oryginalna synteza. Zastosowano wówczas (z grupą zabezpieczającą Fmoc na aminie), której produkt ten poddano bardziej syntetycznym etapom w celu zbadania, czy aminokwasowy środek sieciujący i modyfikacja potranslacyjna (PTM) można wprowadzić do tego samego miejsca białka specyficznie w celu wychwycenia kowalencyjnego oddziaływania aminokwasu zależnego od PTM. PTM regulują interakcje białko-białko, które mają cechy przejściowe i substechiometryczne; co utrudnia ich wykrycie standardowymi metodami. Tak więc, aby sprawdzić, czy to zadziała, użyto domeny MH2 Smad2 , ponieważ wiadomo, że to białko sygnalizacyjne tworzy stabilne homo-trimery, gdy wejdą w kontakt z seryną ufosforylowaną przez receptor pozostałości. Ligację białek ekspresyjnych (znaną jako EPL) zastosowano do syntezy w celu utworzenia Smad2-MH2-CSpSM-photo-Met (1). Produkt badano z łącznikiem sieciującym (photo-Met) przeciwko białku kontrolnemu: HA-MH2-CSpSMpS (to nie zawiera foto-metioniny, 2) przy użyciu SDS-PAGE i Western blotting przy użyciu przeciwciała anty-HA. 1 wygenerował dwa główne usieciowane gatunki, które mają masę cząsteczkową zgodną z dimerem i trimerem Smad2-SH2. Bez tego środka sieciującego dimer i trimer były ledwo wykrywane w nienapromieniowanym 1 iw 2 przed i po napromieniowaniu UV. Udowodnienie, że l-foto-metionina może być stosowana z EPL i może być wykorzystana do określenia przejściowej interakcji MH2-MH2, która była zależna od PTM.
Wykorzystanie foto-metioniny
Interakcje białek
Kompleks i funkcja białka błonowego w homeostazie cholesterolu
Jak wspomniano wcześniej, naukowcy Monika Suchanek, Anna Radzikowski i Christoph Thiele chcieli zbadać interakcje białko-białko w ich naturalnym środowisku. W szczególności białka błonowe (w kompleksie i są to SCAP , Insig-1 i SREBP ), które regulują homeostazę cholesterolu, więc chcieli poznać ich funkcję i złożoną strukturę. Odkryli, że użycie tego fotoreaktywnego aminokwasu było skutecznie włączane do białka przez komórki ssaków, ale nie wymagało stosowania zmodyfikowanych tRNA (transfer RNA) ani AARS (syntazy aminoacylo-tRNA) , które umożliwiły specyficzne potrzebne sieciowanie. To usieciowanie można było określić metodą Western blotting i odkryli oni bezpośrednią interakcję między Insig-1 i PGRMC1 ( białkiem błonowym wiążącym progesteron ). Wszystkie cztery białka błonowe znajdują się w retikulum endoplazmatycznym , a kompleks reaguje na niski poziom cholesterolu. Komórki ( COS7 ), które miały HA ( oznaczony hemaglutyniną PGRMC1) i Myc oznaczone Insig-1 hodowano zi bez foto-Met. W obecności foto-Met, Insig-1 i SCAP uległy usieciowaniu z PGRMC1; w szczególności usieciowany Insig-1 miał silne pasmo. Sieciowanie wykrywano metodą immunoprecypitacji ekstraktów detergentowych z przeciwciałem przeciwko HA, następnie środek strącający badano na obecność Insig-1 stosując technikę Western blotting z przeciwciałem na Myc. Identyczny prążek został znaleziony przy odwrotnej kolejności wykrywania; co oznacza, że przeciwciało Myc poddano immunoprecypitacji, a następnie przeprowadzono blotting z przeciwciałem HA. Tak więc metoda okazała się skuteczna, ponieważ Photo-Met może sieciować białka, ale fizjologiczne implikacje tego sieciowania nie zostały jeszcze określone.
Wykorzystanie nanosond białkowych do badania interakcji białko-białko za pomocą spektrometrii mas
Białko badano za pomocą nanosondy białkowej (umożliwiającej sieciowanie), która wprowadzała foto-metioninę do białka (podczas ekspresji rekombinacyjnej), co prowadziło do zachowania przez białko zarezerwowanej struktury, przy jednoczesnej zdolności do mapowania pod kątem interakcji. Model wykorzystano jako obszar powierzchni kontaktu, który bierze udział w dobrze znanej interakcji (homodimeryzacji) pomiędzy dwiema cząsteczkami białka 14-3-3ζ . Gdy foto-metionina zostanie wprowadzona i zostanie aktywowana za pomocą światła UV, może sieciować się bez specyficzności (czyli bez grupy), a wiązania mają zerową długość. Wysoka rozdzielczość spektrometrię mas lub MS (nawet MS/MS) do określenia usieciowanych reszt i promienia reakcji; umożliwiając naukowcom scharakteryzowanie i zbadanie homodimeryzacji białka. Zastosowanie wysokiej rozdzielczości MS z fotometioniną ma swoje zalety, ponieważ ponownie pozwala białku być w stanie natywnym, istnieją rozsądne skale czasowe przy użyciu małych ilości białka. Istnieje również mniej ograniczeń dotyczących specyficzności reakcji i ograniczeń przy użyciu fotoaktywnego środka sieciującego (foto-metioniny) w porównaniu z sieciowaniem chemicznym . Ta metoda połączonego fotoinicjowanego sieciowania z nanosondy białkowej w tandemie z MS może być użyteczna do scharakteryzowania nie tylko tworzenia homodimerów , ale także oligomerów i teoretycznie; heteromery (takie jak skład mieszaniny białko-białko i jej funkcjonalność).
Umiejętność badania łańcucha transportu elektronów cytochromu P450 przy użyciu fotocytochromu b 5
Cytochrom b 5 zsyntetyzowano z fotometioniną, aby zmapować interakcje białko-białko, jednocześnie identyfikując jego strukturę, aby zbadać ssaczy system oksydazy o mieszanych funkcjach (znany również jako MFO). Układ ten znajduje się w błonie retikulum endoplazmatycznego i składa się z cytochromu P450 , NADPH : reduktazy cytochromu P450 i cytochromu b5 wraz z NADH : reduktazy cytochromu b5 . [ potrzebne źródło ] Gdy kompleks cytochromu b 5 miał wbudowaną foto-metioninę (co oznacza, że foto-met został zastąpiony metioniną, a teraz foto-cyt b 5 ) , foto-cyt b 5 i cytochrom P450 umieszczono w świetle UV i produkty można było badać za pomocą SDS-Page ; ta metoda wykazała trzy wiązania poprzeczne. [ potrzebne źródło ] Foto-metionina okazała się skuteczna w mapowaniu foto-cyt b 5 jako MALDI-TOF metoda wykazała trzy oligomery (z peptydów chymotrypsyny), które składały się z foto-cyt b 5 i cytochromu P450 w stosunkach mas cząsteczkowych 1:1, 1:2 i 2:1. [ potrzebne źródło ] Co sprawia, że foto-metionina jest tutaj tak użyteczna w badaniu cytochromu P450 i cytochromu b 5 polega na tym, że ta metoda nie tylko mapowała interfejsy białko-białko nie tylko w regionach narażonych na działanie rozpuszczalnika, ale także w środowisku natywnym; membrana. Typowa metoda sieciowania może działać tylko w regionach narażonych na działanie rozpuszczalnika, co po raz kolejny dowodzi, że foto-metionina jest przydatna do mapowania interakcji białko-białko z białkiem w ich naturalnym środowisku.
Struktura białka
Analiza interakcji Nidogen-1 z Lamininą γ1
Lamininy to niekolagenowe białka znajdujące się w błonach podstawnych i tworzące sieci poprzez niekowalencyjne interakcje własne. Nidogeny (znane również jako entaktyny) to siarczanowane monomeryczne glikoproteiny , które są wszechobecne w błonach podstawnych organizmów wyższych. Nidogeny pomagają w tworzeniu piwnicy. Gdy obecne są zarówno lamininy, jak i nidogeny, oba oddziałują ze sobą, aby uzyskać stosunek stechiometrii 1: 1 w kompleksie. W celu zbadania krótkiego ramienia lamininy γ1, fotometionina została wprowadzona zarówno do nidogenu-1 , laminina γ1 LEb2-4 i krótkie ramię lamininy γ1, aby sprawdzić, czy ta metoda fotosieciowania może odwzorować strukturę. Analizę MS/MS przeprowadzono przed usieciowaniem, aby stwierdzić, że tylko 13-25% metioniny zostało włączone, ale po indukowaniu UV-A lub innym środkiem sieciującym, usieciowaniu za pośrednictwem BS 2 G (homobifunkcyjny środek sieciujący ), odsetek foto-metioniny wzrósł do 35%. Oba środki sieciujące wykazały dodatkowe informacje strukturalne, zarówno obliczeniowe, jak i eksperymentalne, aby pomóc w zrozumieniu funkcji.
Objawienie struktury dimerycznej i struktury oligomerycznej
cyklooksygenazy-2 (COX-2) i mikrosomalnej syntazy prostaglandyny E2-1 (mPGES-1) badano przy użyciu zarówno fotometioniny (fotoaktywowanej), jak i dwufunkcyjnych łączników sieciujących. Foto-metionina zastosowana w COX-2 wykazała, podobnie jak dwufunkcyjny środek sieciujący, że istnieje struktura dimeryczna, co było zgodne ze strukturą krystaliczną enzymu. W przypadku mPGES-1 komórki ludzkie ( A549 ) traktowano suberynianem disukcynimidylu (chemiczny środek sieciujący) dał dimer o masie cząsteczkowej 33 kDa i trimer o masie 45 kDa, podczas gdy potraktowano go foto-metioniną, dając dimer o tej samej masie cząsteczkowej (33 kDa) i dwa przypuszczalne trimery (50 kDa i 55 kDa). Po wprowadzeniu inhibitora mPGES-1 (MF63); hamowało to tworzenie kompleksów 50 kDa i 55 kDa. Inhibitor nie miał wpływu na dimer i trimer otrzymane przez chemiczny środek sieciujący. Jednak foto-metionina ani suberynian disukcynoimidylu nie wykazały żadnych interakcji białko-białko między COX-2 i mPGES-1, co może wynikać z różnych przyczyn. Dla foto-metioniny; mogło to wynikać z niskiego włączenia w tym czasie, ponieważ wynosiło ono 0,7%. Tak więc dla mPGES-1; ma to 152 aminokwasy, więc tylko jedna foto-metionina byłaby włączona na monomer. Oznacza to również, że żadna konkretna metionina nie zostałaby zastąpiona, co skutkuje heterogenną populacją mPGES-1, co skutkuje różnym usieciowaniem. Mimo że nie wykazywał żadnych interakcji białko-białko, można go wykorzystać do wykrywania wywołanych przez inhibitor zmian konformacyjnych białek w błonach komórkowych, oprócz określenia struktur oligomerycznych.
Komórki Escherichia coli
Foto-metioninę można stosować do znakowania rekombinowanych białek w komórkach Escherichia coli ; chociaż ogólnie metionina jest rzadkim aminokwasem, co oznacza, że może dostarczyć jedynie ograniczonych danych strukturalnych. Niemniej jednak foto-metionina została włączona do kalmoduliny regulującej Ca 2+ (CaM, która miała 17 kDa), która ma dziewięć metionin i była badana za pomocą spektrometrii mas (MS). Tym, co wyróżnia tę metodę, jest użycie pożywki z solami mineralnymi zamiast DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Limiting Medium) lub dializowanej płodowej surowicy bydlęcej do włączenia do komórek. Zastosowanie pożywki z solą mineralną umożliwiło hodowlę komórek od początku w celu wyeliminowania skomplikowanych etapów z innymi protokołami (inkubacja komórek w LB , a następnie płukanie i dalszą inkubację w pożywce zubożonej), co oznacza, że foto-metioninę można było włączyć na samym początku wzrostu komórek, który miał wysoką wydajność powyżej 30%. Foto-metionina nie wykazała żadnych uszkodzeń podczas procesu wzrostu komórek, a po fotoaktywacji przez światło UV-A, CaM miała dziewięć różnych miejsc sieciowania, gdy MS ustaliło, że występują piki CaM znakowanej foto-metioniną. Foto-metioninę można wykorzystać nie tylko do mapowania trójwymiarowej struktury białek, badania interakcji białko-białko, ale także do badania regionów hydrofobowych w białku.