GrpE
GrpE ( GrpE , podobnie jak białko E) jest bakteryjnym czynnikiem wymiany nukleotydów , który jest ważny dla regulacji maszynerii fałdowania białek , jak również odpowiedzi na szok termiczny . Jest białkiem indukowanym ciepłem i podczas stresu zapobiega gromadzeniu się niesfałdowanych białek w cytoplazmie. Nagromadzenie niesfałdowanych białek w cytoplazmie może prowadzić do śmierci komórki.
| Białko GrpE | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Struktura krystaliczna homodimeru GrpE oddziałującego z miejscem wiązania ATPazy DnaK, rozdzielona przy 2,8 angstremów.
| |||||||||
| Identyfikatory | |||||||||
| Symbol | GrpE | ||||||||
| Pfam | PF01025 | ||||||||
| InterPro | IPR000740 | ||||||||
| PROZYTA | PS01071 | ||||||||
| SCOP2 | 1 dkg / ZAKRES / SUPFAM | ||||||||
| CDD | cd00446 | ||||||||
| |||||||||
Odkrycie
GrpE to czynnik wymiany nukleotydów, który po raz pierwszy został odkryty przez naukowców w 1977 r. jako białko niezbędne do namnażania bakteriofaga λ , wirusa infekującego bakterie poprzez przejęcie ich własnej maszynerii replikacyjnej w Escherichia coli . Korzystając z badań genetycznych, naukowcy wyeliminowali określone geny w E. coli , a następnie zbadano, czy bakteria jest zdolna do replikacji, stwierdzono, że GrpE ma kluczowe znaczenie dla rozmnażania. Od tego czasu GrpE zidentyfikowano we wszystkich bakteriach oraz w Archaea, w których DnaK i DnaJ .
Strukturę krystaliczną GrpE określono w 1997 r. przy 2,8 angstremów i zidentyfikowano GrpE jako homodimer, który wiąże DnaK, białko szoku cieplnego zaangażowane w fałdowanie białek de novo . Określenie struktury GrpE było ważne, ponieważ wykazało interakcję czynników wymiany nukleotydów w domenie wiążącej nukleotyd DnaK.
Struktura
Domeny funkcjonalne
Homodimer GrpE ma trzy odrębne domeny:
- N-końcowe nieuporządkowane regiony — Aminokwasy 1-33 w domenie N-końcowej mogą konkurować o wiązanie z szczeliną wiążącą substrat DnaK. Aminokwasy 34-39 nie zostały zwizualizowane, ponieważ są albo zbyt nieuporządkowane, albo zbyt nieustrukturyzowane, aby mogły ulec krystalizacji.
- α-helisy — Istnieją cztery α-helisy, dwie krótkie i dwie długie, przypominające łodygi i równoległe do siebie. Te helisy łączą się, tworząc spiralną wiązkę, jednak nie ma superhelikalnego skręcenia z powodu odstępów heptad-hendecad (7-11-7-11) reszt hydrofobowych w tych helisach. Części tej spiralnej wiązki są w stanie wiązać się z domeną IIB DnaK. Helisy te działają również jako czujniki termiczne.
- C-końcowe arkusze β — Istnieją dwa zwarte arkusze β, które wystają z helis jak ramiona. Arkusz β w pobliżu DnaK oddziałuje bezpośrednio ze swoją szczeliną wiążącą ATP, wkładając się do szczeliny i powodując zmianę konformacyjną w domenie IIB, powodując uwolnienie ADP. Dystalny arkusz β nie oddziałuje z DnaK.
Wiązanie indukuje zmianę konformacyjną
Wiązanie bliższego arkusza β GrpE z domeną IIB DnaK powoduje obrót o 14° na zewnątrz szczeliny wiążącej nukleotyd, przerywając wiązanie trzech łańcuchów bocznych z pierścieniami adeninowymi i rybozowymi nukleotydu. Ta zmiana konformacyjna przesuwa DnaK z konformacji zamkniętej do otwartej i umożliwia uwolnienie ADP ze szczeliny wiążącej.
Funkcjonować
Czynnik wymiany nukleotydów
Czynniki wymiany nukleotydów to białka, które katalizują uwalnianie difosforanu adenozyny (ADP) w celu ułatwienia wiązania trójfosforanu adenozyny (ATP). ATP ma trzy grupy fosforanowe, a usunięcie jednej z grup fosforanowych uwalnia energię, która jest wykorzystywana do napędzania reakcji. To usunięcie grupy fosforanowej redukuje ATP do ADP. GrpE jest czynnikiem wymiany nukleotydów, który powoduje uwolnienie związanego ADP z DnaK, białka szoku cieplnego ważnego in de novo fałdowanie białek. DnaK, w swojej otwartej konformacji, wiąże ATP z niskim powinowactwem i ma szybki współczynnik wymiany dla niesfałdowanych białek. Gdy DnaJ, współ-opiekuńczy, wprowadza niezłożone białko do DnaK, ATP ulega hydrolizie do ADP, aby ułatwić fałdowanie białka. W tym momencie kompleks DnaK•ADP ma stabilną konformację i wymaga GrpE do wiązania DnaK, zmiany jego konformacji i uwalniania ADP z N-końcowej domeny ATPazy DnaK. Po zwolnieniu ADP z cyklu można kontynuować.
Kinetyka
Oddziaływanie między GrpE a szczeliną wiążącą nukleotyd DnaK jest silne z Kd ) między 1 nM (oceniane podczas aktywnej konformacji przy użyciu kinetyki przejściowej ) a Kd 30 nM (w oparciu o nieaktywną konformację poprzez powierzchniowy rezonans plazmonowy . Ta niska stała dysocjacji wskazuje, że GrpE łatwo wiąże się z DnaK. Wiązanie GrpE z DnaK•ADP znacznie zmniejsza powinowactwo ADP do DnaK 200-krotnie i przyspiesza szybkość uwalniania nukleotydów 5000-krotnie. Proces ten ułatwia de novo niesfałdowanego białka przez DnaK.
Fałdowanie białek
GrpE odgrywa również ważną rolę w uwalnianiu substratu z DnaK. Nieuporządkowany region N-końcowy GrpE konkuruje o wiązanie z szczeliną wiążącą substrat DnaK. Badacze zmutowali GrpE, aby zidentyfikować funkcję jego domen strukturalnych. Zmutowany GrpE, bez swojej nieuporządkowanej domeny N-końcowej, jest nadal zdolny do wiązania się ze szczeliną wiążącą nukleotyd DnaK i indukowania zmiany konformacyjnej, jednak substrat nie zostanie uwolniony.
Czujnik temperatury
GrpE jest czynnikiem wymiany nukleotydów dla DnaK, białka szoku cieplnego, którego aktywność zmniejsza się wraz ze wzrostem temperatury. W biologii odwracalne rozwijanie helis α rozpoczyna się w temperaturze 35 ° C z punktem środkowym Tm równym 50 ° C, to rozwijanie wpływa na integralność strukturalną GrpE i zapobiega wiązaniu GrpE do szczeliny wiążącej nukleotyd DnaK Ma to ważną rolę fizjologiczną w celu ograniczenia cyklu substratu i późniejszego wydatkowania ATP podczas stresu cieplnego. Regulacja termiczna DnaK spowalnia fałdowanie białek i zapobiega gromadzeniu się niesfałdowanych białek w cytoplazmie w wysokich temperaturach.
Replikacja bakteriofaga λ
GrpE został po raz pierwszy zidentyfikowany ze względu na jego rolę w replikacji faga λ. GrpE, który został zmutowany tak, że jest niefunkcjonalny, zapobiega replikacji faga λ in vivo i znacznie zmniejsza replikację in vitro . Nadekspresja DnaK in vitro może odzyskać replikację faga λ bez GrpE. Kluczowa rola GrpE w replikacji faga λ jest początkiem replikacji, po złożeniu DnaB i innych czynników replikacyjnych, GrpE ułatwia dwukierunkowe rozwijanie DNA poprzez interakcję z DnaK.
Rozporządzenie
Transkrypcja
genomie Archaea gen GrpE znajduje się powyżej genu DnaK, który znajduje się powyżej genu DnaJ . Spośród tych trzech białek tylko region promotora GrpE ma kompletną skrzynkę wiążącą TATA i górne miejsce wiązania reagujące na ciepło. Sugeruje to, że u Archaea te trzy geny są transkrybowane w tym samym czasie.
W E. coli transkrypcja GrpE jest regulowana przez wiązanie σ32 specyficznej dla szoku cieplnego podjednostki polimerazy RNA . W warunkach fizjologicznych σ 32 jest utrzymywane na niskim poziomie poprzez inaktywację przez interakcję z DnaK i DnaJ, a następnie degradację przez proteazy . Jednak podczas szoku cieplnego białka te nie są w stanie oddziaływać z σ 32 i kierować go do degradacji. Dlatego podczas szoku cieplnego σ 32 wiąże się z regionem promotorowym białek szoku cieplnego i powoduje szybką indukcję tych genów.
Inne systemy biologiczne
Homologi eukariontów
W Saccharomyces cerevisiae homolog GrpE, Mge1, znajduje się w mitochondriach . Mge1 jest czynnikiem wymiany nukleotydów, ważnym dla przemieszczania białek przez błony mitochondrialne i fałdowania białek, oddziałuje z drożdżowym homologiem DnaK. Mge1 pełni podobną rolę jak termosensor. Drożdże mają dodatkowe homologi GrpE, w tym Sil1p i Fes1p. U ludzi organelle mitochondrialne mają białko podobne do GrpE 1 (GRPEL1).
W komórkach eukariotycznych istnieje wiele dodatkowych eukariotycznych homologów GrpE. Członkowie rodziny BAG, w szczególności BAG1 , są głównymi czynnikami wymiany nukleotydów dla białka szoku cieplnego 70kDa (Hsp70), które jest eukariotycznym odpowiednikiem DnaK. Inne czynniki wymiany nukleotydów, które oddziałują z białkami szoku cieplnego u eukariontów, obejmują Sse1p, Sil1p, Hip i HspBP1 . Wszystkie te eukariotyczne czynniki wymiany nukleotydów są indukowane szokiem termicznym, co oznacza, że pełnią podobną funkcję jak GrpE, chroniąc komórkę przed agregacją niesfałdowanych białek. Te czynniki wymiany nukleotydów zawsze oddziałują z subdomeną IIB szczeliny wiążącej nukleotyd ich odpowiednich białek szoku cieplnego. Wiązanie czynnika wymiany nukleotydów ze szczeliną wiążącą nukleotyd i przejście do konformacji otwartej jest zachowane między prokariotami i eukariontami.
Homologie roślin
U roślin homologi GrpE, CGE1 i CGE2, znajdują się w chloroplastach . CGE1 ma dwie izoformy składania, które różnią się 6 aminokwasami na N-końcu, przy czym izoforma CGE1b jest o 6 nukleotydów dłuższa niż CGE1a. Ta domena N-końcowa jest ważna w uwalnianiu substratu poprzez konkurencyjne wiązanie z białkiem szoku cieplnego. Wszystkie te roślinne czynniki wymiany nukleotydów oddziałują bezpośrednio z cpHsc70, roślinnym homologiem DnaK. Są indukowane ciepłem, jednak w temperaturze 43 ° C nie są tak skuteczne jak GrpE w ochronie komórki przed akumulacją niesfałdowanych białek.
Rola w chorobie
Patogeneza bakteryjna
Enterokoki to bakterie powszechnie występujące w przewodzie pokarmowym zwierząt, w tym ludzi. Bakterie te mogą tworzyć biofilm , czyli warstwę bakterii przyczepioną do powierzchni. Biofilm enterokokowy jest powszechny w warunkach szpitalnych i chirurgicznych, odpowiada za 25% infekcji związanych z cewnikiem, znajduje się w 50% zębów wypełnionych korzeniami z zapaleniem przyzębia wierzchołkowego i może być izolowany z innych ran. GrpE znajduje się w genomie Enterococcus faecilis i Enterococcus faecium i ma kluczowe znaczenie dla przyczepiania się biofilmu enterokoków do polistyrenu rurki, plastikowy polimer powszechnie stosowany w warunkach szpitalnych.
Grupa A Streptococcus pyogenes to bakteria, która może prowadzić do powszechnych infekcji, w tym anginy i liszajec , ale jest również odpowiedzialna za infekcje zagrażające życiu. Podczas infekcji GrpE pomaga paciorkowców przylegać do komórek nabłonka gardła . GrpE w Streptococcus wiąże się z endogennymi białkami bogatymi w prolinę w ślinie, umożliwiając adhezję bakterii do żywiciela.