Immuno-elektronowa mikroskopia
Immunoelektronowa mikroskopia (częściej nazywana immunoelektronową mikroskopią ) jest odpowiednikiem immunofluorescencji , ale wykorzystuje mikroskopię elektronową zamiast mikroskopii świetlnej . Mikroskopia immunoelektronowa identyfikuje i lokalizuje interesującą cząsteczkę, w szczególności białko będące przedmiotem zainteresowania, poprzez przyłączenie jej do określonego przeciwciała . To wiązanie może powstać przed lub po osadzeniu komórek w szkiełkach. Między antygenem a przeciwciałem zachodzi reakcja , w wyniku której ten znacznik staje się widoczny pod mikroskopem. Skaningowa mikroskopia elektronowa jest realną opcją, jeśli antygen znajduje się na powierzchni komórki, ale może być potrzebna transmisyjna mikroskopia elektronowa , aby zobaczyć etykietę, jeśli antygen znajduje się w komórce.
Proces
Antygeny i ich odpowiednie przeciwciała (zwykle dwa) wchodzą w interakcję w sekcji. Następnie transmisyjna mikroskopia elektronowa wykrywa przeciwciało, a tym samym białko. Drugie przeciwciało jest zwykle związane ze złotem, ponieważ złoto ma wysoką liczbę atomową , co sprawia, że jest bardzo gęste. Cząsteczki złota koloidalnego sprawiają, że przeciwciała stają się widoczne poprzez koniugację z nimi, ponieważ znana jest ich dokładna średnica. Kiedy elektrony przechodzą przez mikroskop, uderzają w tę cząstkę złota. Gęsty atom złota odbija elektrony emitowane z mikroskopu elektronowego i powoduje pojawienie się cząstki docelowej w próbce.
Inny możliwy proces obejmuje Białko A , które pochodzi z bakterii . Trwale pokrywa atom złota i wiąże się z regionem stałym przeciwciał. Proces ten wykorzystuje Białko A jako zamiennik drugorzędowego, w związku z czym wymaga tylko jednego przeciwciała. Białko A sprawia, że białko docelowe jest widoczne. W ten sposób cały proces skutkuje lokalizacją i wizualizacją docelowego białka.
Podczas korzystania z immunologicznej mikroskopii elektronowej próbka może być albo w cienkich skrawkach, aby elektrony mogły ją przeniknąć, albo zabarwiona negatywnie. Barwienie ujemne ma wyższą rozdzielczość, ale może identyfikować tylko cząsteczki, które byłyby rozpoznawalne, gdyby stały samodzielnie. W przypadku zastosowania w immunologicznej mikroskopii elektronowej, barwienie ujemne wszczepia małą cząsteczkę do próbki, lepiej rozdzielając jej struktury. Zaletą mikroskopii immunoelektronowej jest to, że umożliwia rozpoznawanie cząstek bez względu na kontekst.
Komplikacje i wyniki
Potencjalne komplikacje
Skrawki pod mikroskopem muszą być bardzo cienkie, aby elektrony mogły przez nie przejść. Podczas czynności przygotowawczych niezbędnych do utworzenia cienkich skrawków mogą wystąpić pewne komplikacje, w tym utrwalanie chemiczne i osadzanie (zwykle w plastiku). Te ostre preparaty mogą denaturować antygeny, przerywając ich niezbędne wiązanie z przeciwciałami. Naukowcy wynaleźli i wykorzystali specyficzne procesy, aby obejść te problemy i zachować interakcję między antygenem a przeciwciałami. Metody te obejmują raczej utrwalanie światłem niż utrwalanie chemiczne, zamrażanie próbki przed pocięciem na skrawki i inkubację w temperaturze pokojowej, a nie w wysokich temperaturach.
Wiązania między przeciwciałami i ich odpowiednimi antygenami lub między przeciwciałami i ich złotymi znacznikami mogą być tylko częściowo bezpieczne ze względu na wpływ niskich stężeń lub zawady sterycznej na wiązanie. Grupy kontrolne są niezbędne, aby uwzględnić ilość znakowania, które występuje naturalnie bez wirusa.
Wyniki
Wyniki z immunologicznej mikroskopii elektronowej są zazwyczaj określane ilościowo wizualnie. Aby analiza ilościowa była skuteczna , próbka musi posiadać określone cechy , ograniczające częstotliwość jej stosowania. Ma zastosowanie w sytuacjach, takich jak sprawdzanie, ile cząstek koloidalnego złota jest przyłączonych do konkretnego przeciwciała. Podczas udanych eksperymentów immunologiczna mikroskopia elektronowa może dokładnie zlokalizować białka i poprawić zrozumienie związku między strukturą a funkcją. Te procesy znakowania i lokalizacji pomagają naukowcom zrozumieć różne szlaki i procesy komórkowe.
Historia
W 1931 roku Ernst Ruska (laureat Nagrody Nobla z 1986 roku) i Max Knoll stworzyli pierwszy mikroskop elektronowy. Wynalazek ten doprowadził do powstania skaningowego mikroskopu elektronowego i transmisyjnego mikroskopu elektronowego, które później przyczyniły się do powstania mikroskopii immunoelektronowej. Początkowo technologia pozwalała tylko na obrazy dwuwymiarowe, ale teraz dzięki nowoczesnej technologii dostępne są również obrazy trójwymiarowe.
Mikroskopia immunoelektronowa powstała, gdy dwie niezależne grupy w latach czterdziestych XX wieku połączyły wirusa mozaiki tytoniu i jego surowicę odpornościową. Następnie zbadali go pod mikroskopem elektronowym. W tym czasie rozdzielczość była znacznie gorsza z powodu braku dodatkowego kontrastu i kiepskiej jakości mikroskopów tamtych czasów. Wiadomo, że cząstki użyte w eksperymencie miały kształt pręta, a obie grupy badaczy odkryły, że te pręty zbijają się razem w grupie mniej więcej dwa razy większej niż pierwotna. Ponad półtorej dekady później naukowcy zaczęli wykorzystywać pojedyncze przeciwciała przyczepione do wirusów. Wreszcie, w 1962 roku, pojawiły się przeciwciała wybarwione negatywnie.
Aplikacje
Wirusy
Transmisyjna mikroskopia elektronowa z powodzeniem dostarcza ogólnych informacji o strukturze, ale ma trudności z rozróżnieniem bardziej szczegółowych części wirusa lub komórki. Mikroskopia immunoelektronowa pomaga w diagnozowaniu infekcji wirusowych i lokalizowaniu antygenów wirusowych w szczepionkach. Mikroskopia immunoelektronowa może w wystarczającym stopniu diagnozować choroby i identyfikować patogeny . Jednym z przykładów jest jego zdolność do przedstawiania mieliny na błonie podstawnej . Uszkodzenie to może być związane z wolniejszymi impulsami nerwowymi, co skutkuje szerokim zakresem problemów poznawczych i fizycznych. Inny przykład obejmuje identyfikację zmian skórnych . W tym przypadku naukowcy odkryli niewystarczające włókna zakotwiczające w błonie podstawnej, co spowodowało, że skóra stała się bardziej delikatna. W obu przypadkach naukowcy zidentyfikowali określony antygen, który należy obrać za cel, aby wykorzystać immunologiczną mikroskopię elektronową do odkrycia i zdobycia większej wiedzy na temat tych chorób.
Biopsje nerek
Początkowo biopsje nerki wykorzystywały mikroskopię immunofluorescencyjną, która zapewniała niższą rozdzielczość niż mikroskopia immunoelektronowa. Przed przejściem z mikroskopii świetlnej na mikroskopię elektronową wyniki pokazały liczne biopsje wymagające dodatkowej mikroskopii elektronowej, aby zapewnić dokładniejszą diagnozę. Dodatkowe zastosowanie mikroskopii immunoelektronowej nastąpiło zarówno w celu postawienia wstępnej diagnozy, jak i potwierdzenia wyników mikroskopii świetlnej. Naukowcy postanowili przeprowadzić badania naukowe nad skutecznością każdego rodzaju mikroskopii. W wielu przypadkach, używając jedynie mikroskopii świetlnej, lekarze nie byli w stanie postawić wstępnej diagnozy. Kilku miało nawet błędne diagnozy. Rodzaj diagnozy również odegrał kluczową rolę w eksperymencie. Fluorescencyjna mikroskopia świetlna dokładnie identyfikowała niektóre diagnozy bez konieczności dalszej obserwacji. Inne były znacznie trudniejsze do rozróżnienia i wymagały mikroskopii elektronowej. Nawet u pacjentów, u których mikroskopia immunofluorescencyjna dała prawidłowe wyniki, naukowcy nadal uważali, że potrzebne jest potwierdzenie. Wyniki tego badania wykazały potrzebę przejścia z mikroskopii świetlnej na mikroskopię elektronową w diagnostyce biopsji nerki.