Inżynieria cytochromu P450
Ten artykuł dotyczy inżynierii białek enzymów cytochromu (CYP) P450 . P450 są zaangażowane w szereg biochemicznych procesów katabolicznych i anabolicznych . Naturalne P450 mogą przeprowadzać kilka różnych typów reakcji chemicznych, w tym hydroksylacje , N,O,S-dealkilacje , epoksydacje , sulfoksydacje, sprzęgania arylo-arylowe , skurcze i ekspansje pierścieni , cyklizacje oksydacyjne, utleniania alkoholowe/aldehydowe, desaturacje , utleniania azotu, dekarboksylacje , nitracje oraz dehalogenacje oksydacyjne i redukujące . Wysiłki inżynieryjne często dążą do 1) ulepszonej stabilności 2) ulepszonej aktywności 3) ulepszonego zakresu podłoża 4) umożliwienia zdolności do katalizowania nienaturalnych reakcji. Inżynieria P450 to rozwijająca się dziedzina w dziedzinie biologii chemicznej i syntetycznej chemii organicznej (chemoenzymatycznej).
Podejścia do inżynierii enzymów cytochromu P450
Racjonalny
Racjonalna inżynieria enzymów charakteryzuje się tworzeniem określonych mutacji aminokwasów w oparciu o informacje mechanistyczne lub strukturalne. Podczas gdy enzymy P450 są dobrze poznane pod względem mechanistycznym, mutacje oparte na informacjach strukturalnych są często ograniczone krystalizacji . Chociaż, gdy jest to możliwe, wysoki stopień elastyczności i plastyczności miejsca aktywnego obecny w P450 powoduje, że struktury krystaliczne są w dużej mierze przestarzałe dla racjonalnego projektowania. Kolejna kwestia pojawia się przy próbie rozszerzenia zakresu podłoża. miejsca aktywnego P450 , co z kolei może skutkować wieloma orientacjami dokowania substratu , co skutkuje słabą regio-/stereoselektywnością.
Kierowana ewolucja
Kierowana ewolucja to strategia inżynierii enzymatycznej zaprojektowana w celu naśladowania doboru naturalnego w warunkach laboratoryjnych. Ze względu na trudność we wdrażaniu racjonalnych strategii projektowania ukierunkowana ewolucja stała się strategią z wyboru dla inżynierii P450. W tym przypadku mutacje można wprowadzać półracjonalnie lub losowo poprzez mutagenezę nasycenia miejsca . Powstały mutant P450 (zwykle biblioteka mutantów) jest następnie przeszukiwany pod kątem pożądanej aktywności. Mutanty wykazujące ulepszone właściwości są kierowane do kolejnych rund mutagenezy, powtarzając ten cykl, aż pożądana funkcja zostanie odpowiednio spełniona.
Przykłady inżynieryjne P450
P450 BM3
P450 BM3 (znany również jako CYP102A1) jest enzymem cytochromu P450 wyizolowanym z Bacillus megaterium . BM3 był szeroko badany w kontekście inżynierii enzymów ze względu na jego rozpuszczalność, łatwe do ułożenia izoformy bakteryjne i samowystarczalny system transportu elektronów, ale także ze względu na jego syntetyczną użyteczność. Badania inżynieryjne wykazały, że mutanty BM3 mogą 1) być wyposażone w nowe i zróżnicowane zakresy substratów 2) wykazywać regio-/stereoselektywność na nowych substratach i 3) być zaprojektowane tak, aby były wysoce selektywne i aktywne w stosunku do nowych substratów. Warianty BM3 są szczególnie przydatne do produkcji zapachów , aromatów , feromonów i farmaceutyków . Kwas artemizynowy (wykorzystywany do produkcji naturalnego produktu farmaceutycznego artemizyniny ) został wyprodukowany z wykorzystaniem wariantu BM3 odpowiedzialnego za epoksydowanie dwóch alkenów obecnych w amorfa-4,11-dienie. Utlenianie walencenu do nootkatonu (ceniony smak grejpfruta) przeprowadzono z wykorzystaniem mutanta F87T i I263A (ryc. 1).
-valencene_with_P450cam_mutants.png)
Ostatnio Wang i in. opisali wariant BM3 zdolny do przeprowadzania cyklopropanacji styrenyloolefiny . Ponieważ natywna BM3 wykazuje słabą aktywność cyklopropanacji, podjęto prace inżynierii enzymatycznej. W swoim rdzeniu, P450 są enzymami tiolanowymi, które wykorzystują tlen cząsteczkowy (O 2 ) i NAD(P)H do przeprowadzania reakcji utleniania. W związku z tym BM3 woli przeprowadzać epoksydowanie w przeciwieństwie do reakcji cyklopropanowania w obecności olefin. Reakcję między diazooctanem etylu (EDA) i 1 wybrano jako reakcję modelową ze względu na znaną trudność epoksydowania olefin z niedoborem elektronów z wykorzystaniem katalizy metalami przejściowymi (ryc. 2). W wyniku tej reakcji powstaje związek 2 , który można łatwo przekształcić w lewomilnacipran (Fetzima), środek farmaceutyczny stosowany w leczeniu depresji klinicznej . Na początek wygenerowano mutanty, w których resztę cysteiny koordynującą osiowo w centrum katalitycznym zastąpiono aminokwasami seryną, alaniną, metioniną, histydyną i tyrozyną. Mutant T268A-axH, który ma osiowy ligand histydynowy, katalizował reakcję między EDA a 1 z wydajnością 81% z diastereoselektywnością 6:94 i enancjoselektywnością 42%. Następnie przeprowadzono kolejne rundy mutagenezy wysycania miejsc, w wyniku czego otrzymano wariant o nazwie BM3-Hstar (zawierający mutacje T268A-axH, L437W, V78M i L181V), który mógł katalizować modelową reakcję z wydajnością większą niż 92%, enancjoselektywnością 92 % i 2:98 diastereoselektywność. Dodatkową korzyścią jest to, że BM3-Hstar był również w stanie przeprowadzić pożądaną reakcję cyklopropanacji w obecności tlenu atmosferycznego (O2) (jedyny znany wariant BM3, który to umożliwia).
_catalyzed_by_BM3-Hstar.png)
125 CYP
Oprócz użyteczności syntetycznej, enzymy P450 zostały również opracowane w celu lepszego zrozumienia ich biochemii. W oparciu o proponowany cykl katalityczny, osiowo zligowane ugrupowanie tiolanowe (cysteina) przekazuje gęstość elektronów do centrum metalu, pomagając w protonowaniu anionu żelazowo-nadtlenowego ( − OO-Fe 3+ ), który po utracie wody generuje reaktywne żelazo z wiązaniem CH gatunki -okso (O=Fe4 + ). Alternatywnie, jeśli anion żelazowo-perokso pozostaje nieprotonowany, ten reaktywny związek może pośredniczyć w rozszczepianiu wiązania CC w substratach zawierających aldehyd (deformylacja). Aby lepiej zrozumieć dychotomię pośrednią między anionem żelazowo-perokso i żelazem-okso, CYP125 (który jest odpowiedzialny za różne procesy metaboliczne, w tym degradację cholesterolu) został zaprojektowany w celu zastąpienia osiowo zligowanej reszty cysteiny selenocysteiną (SeCYP125). Z kolei zaobserwowano, że SeCYP125 sprzyja tworzeniu produktów utlenionych w porównaniu z produktami zdeformylowanymi w reakcji z cholesterolem-26-aldehydem, co wskazuje, że zwiększone oddawanie elektronów z selenocysteiny w stosunku do cysteiny skutkuje wyższą proporcją żelaza-okso w stosunku do anionu żelazowo-perokso (Rysunek 3).
Ir(Me)-CYP119-Maks
W 2016 roku praca opublikowana przez Dydio i in. opisali sztuczny metaloenzym zdolny do katalizowania wewnątrz- / międzycząsteczkowych insercji karbenu CH do aktywowanych / nieaktywowanych wiązań CH, z kinetyką podobną do enzymu natywnego (ryc. 4). Zgłoszony katalizator został opracowany przez zamianę kofaktora żelazo-protoporfiryna w termostabilnym enzymie P450 CYP119A1 na kofaktor irydowo-metyloprotoporfirynowy ( Ir(Me)-PIX), a następnie ukierunkowaną ewolucję. Następnie otrzymano CYP119-Max, poczwórnego mutanta (C317G, T213G, L69V, V254L). Nadmiar enancjomeryczny (ee) do ±98% uzyskano przy stałym obciążeniu katalizatora wynoszącym 0,17% molowych. CYP119-Max może również ulegać reakcjom wstawiania międzycząsteczkowego, aczkolwiek z umiarkowanym ee (68%). Aby zademonstrować przydatność CYP119-Max w produkcji wysokowartościowych chemikaliów, reakcja w skali 200 mM dała 2,3-dihydrobenzofurano-3-karboksylan etylu z wydajnością 44%, z liczbą obrotów 35 000 (TON) i 93% ee.
-PIX-CYP119_C317G.png)