Hamowanie niekonkurencyjne

Nie należy mylić z niekonkurencyjnym inhibitorem .

„Niekonkurencyjne” przekierowuje tutaj. W przypadku innych zastosowań zobacz Konkurencja .

Hamowanie niekonkurencyjne to rodzaj hamowania enzymu , w którym inhibitor zmniejsza aktywność enzymu i wiąże się równie dobrze z enzymem, niezależnie od tego, czy już związał substrat. Jest to odmienne od hamowania allosterycznego , w którym powinowactwo wiązania substratu w enzymie zmniejsza się w obecności inhibitora.

Inhibitor może wiązać się z enzymem niezależnie od tego, czy substrat został już związany, ale jeśli ma większe powinowactwo do wiązania enzymu w jednym lub drugim stanie, nazywany jest inhibitorem mieszanym .

Historia

Podczas swoich lat pracy jako lekarz Michaelis i jego przyjaciel (Peter Rona) zbudowali kompaktowe laboratorium w szpitalu iw ciągu pięciu lat – Michaelis z powodzeniem został opublikowany ponad 100 razy. Podczas swoich badań w szpitalu jako pierwszy zapoznał się z różnymi rodzajami zahamowań; w szczególności stosując fruktozę i glukozę jako inhibitory maltazy . Maltaza rozkłada maltozę na dwie jednostki glukozy Wyniki tego eksperymentu pozwoliły na rozbieżność hamowania niekonkurencyjnego i konkurencyjnego . Hamowanie niekonkurencyjne wpływa na k _cat (ale nie K _m ) na dowolnym danym wykresie; ten inhibitor wiąże się z miejscem, które ma specyficzność dla określonej cząsteczki. Michaelis ustalił, że po związaniu inhibitora enzym ulegnie dezaktywacji.

Podobnie jak wielu innych naukowców swoich czasów, Leonor Michaelis i Maud Menten pracowali nad reakcją, która posłużyła do zmiany składu sacharozy i spowodowania jej lizy na dwa produkty – fruktozę i glukozę. Enzym biorący udział w tej reakcji nazywa się inwertazą i jest to enzym, którego kinetyka została uznana przez Michaelisa i Mentena za rewolucyjną dla kinetyki innych enzymów. Wyrażając szybkość badanej reakcji, wyprowadzili równanie opisujące szybkość w sposób sugerujący, że zależy ona głównie od stężenia enzymu, a także od obecności substratu, ale tylko w pewnym stopniu.

Adriana Browna i Victora Henriego położył podwaliny pod odkrycia kinetyki enzymów, z których znani są Michaelis i Menten. Brown teoretycznie przewidział mechanizm akceptowany obecnie w kinetyce enzymów, ale nie miał danych ilościowych, aby móc to stwierdzić. Victor Henri wniósł znaczący wkład w kinetykę enzymów podczas swojej pracy doktorskiej, jednak brakowało mu zwrócenia uwagi na znaczenie stężenia jonów wodorowych i mutarotacji glukozy. Celem pracy Henriego było porównanie jego wiedzy na temat reakcji katalizowanych przez enzymy z uznanymi prawami chemii fizycznej. Henri jest uznawany za pierwszego, który napisał równanie, które jest obecnie znane jako równanie Michaelisa-Mentena. Wykorzystując glukozę i fruktozę w reakcjach katalitycznych kontrolowanych przez maltazę i inwertazę, Leonor Michaelis był pierwszym naukowcem, który rozróżnił różne rodzaje hamowania za pomocą skali pH, która nie istniała w czasach Henriego.

Szczególnie podczas pracy nad opisem szybkości tej reakcji testowali również i ekstrapolowali pomysł innego naukowca, Victora Henriego , że używany przez nich enzym ma pewne powinowactwo do obu produktów tej reakcji – fruktozy i glukozy. Korzystając z metod Henriego, Michaelis i Menten prawie udoskonalili tę koncepcję metody szybkości początkowej dla eksperymentów w stanie ustalonym. Badali hamowanie, kiedy odkryli, że niekonkurencyjne (mieszane) hamowanie charakteryzuje się wpływem na k _kotów (szybkość katalizatora), podczas gdy konkurencyjny charakteryzuje się wpływem na prędkość (V). W eksperymentach Michaelisa i Mentena mocno skupili się na wpływie inwertazy na pH przy użyciu jonów wodorowych. Inwertaza jest enzymem występującym w zewnątrzkomórkowych drożdżach i katalizującym reakcje poprzez hydrolizę lub inwersję sacharozy (mieszaniny sacharozy i fruktozy) do „ cukru inwertowanego ”. Głównym powodem zastosowania inwertazy była łatwość jej oznaczania i szybsze przeprowadzanie eksperymentów. Sacharoza obraca się w polarymetrze jako prawoskrętny-D , podczas gdy cukier inwertowany jest lewoskrętny-L . Dzięki temu śledzenie inwersji cukru było stosunkowo proste. Odkryli również, że α-D-glukoza jest uwalniana w reakcjach katalizowanych przez inwertazę, która jest bardzo niestabilna i samoistnie zmienia się w β-D-glukozę . Chociaż oba są w formie prawoskrętnej, tutaj zauważyli, że glukoza może zmieniać się spontanicznie, co jest również znane jako mutarotacja. Nieuwzględnienie tego było jednym z głównych powodów niepowodzenia eksperymentów Henriego. Używając inwertazy do katalizowania inwersji sacharozy, mogli zobaczyć, jak szybko enzym reagował za pomocą polarymetrii; dlatego stwierdzono, że w reakcji, w której sacharoza została odwrócona inwertazą, wystąpiło niekonkurencyjne hamowanie.

Terminologia

Należy zauważyć, że chociaż wszystkie niekonkurencyjne inhibitory wiążą enzym w miejscach allosterycznych (tj. w miejscach innych niż jego miejsce aktywne ) – nie wszystkie inhibitory, które wiążą się w miejscach allosterycznych, są inhibitorami niekonkurencyjnymi. W rzeczywistości inhibitory allosteryczne mogą działać jako inhibitory kompetycyjne , niekompetycyjne lub niekompetycyjne .

Wiele źródeł nadal łączy te dwa terminy lub podaje definicję hamowania allosterycznego jako definicję hamowania niekonkurencyjnego.

Mechanizm

Ilustracja możliwego mechanizmu hamowania niekonkurencyjnego lub mieszanego.

Hamowanie niekonkurencyjne modeluje system, w którym zarówno inhibitor, jak i substrat mogą być związane z enzymem w dowolnym momencie. Kiedy zarówno substrat, jak i inhibitor są związane, kompleks enzym-substrat-inhibitor nie może tworzyć produktu i może być jedynie przekształcony z powrotem w kompleks enzym-substrat lub kompleks enzym-inhibitor. Hamowanie niekonkurencyjne różni się od ogólnego hamowania mieszanego tym, że inhibitor ma równe powinowactwo do enzymu i kompleksu enzym-substrat.

Na przykład w katalizowanych enzymatycznie reakcjach glikolizy gromadzenie fosfoenolu jest katalizowane przez kinazę pirogronianową do pirogronianu . Alanina jest aminokwasem syntetyzowanym z pirogronianu, hamuje również enzym kinazę pirogronianową podczas glikolizy. Alanina jest inhibitorem niekonkurencyjnym, dlatego wiąże się z miejsca aktywnego z substratem, aby nadal był produktem końcowym.

Innym przykładem niekonkurencyjnego hamowania jest heksokinaza hamująca glukozo-6-fosforan w mózgu. Węgle 2 i 4 na glukozo-6-fosforanie zawierają grupy hydroksylowe, które przyłączają się wraz z fosforanem przy węglu 6 do kompleksu enzym-inhibitor. Substrat i enzym różnią się kombinacjami grup, do których przyłącza się inhibitor. Zdolność glukozo-6-fosforanu do wiązania się w różnych miejscach w tym samym czasie czyni go niekonkurencyjnym inhibitorem.

Najpowszechniejszy mechanizm niekonkurencyjnego hamowania obejmuje odwracalne wiązanie inhibitora z miejscem allosterycznym , ale możliwe jest, aby inhibitor działał innymi sposobami, w tym bezpośrednim wiązaniem z miejscem aktywnym. Różni się od hamowania konkurencyjnego tym, że wiązanie inhibitora nie zapobiega wiązaniu substratu i odwrotnie, ale po prostu zapobiega tworzeniu się produktu przez ograniczony czas.

Ten rodzaj hamowania zmniejsza maksymalną szybkość reakcji chemicznej bez zmiany widocznego powinowactwa wiązania katalizatora z substratem (Km _app ^– patrz kinetyka Michaelisa-Mentena ) . Po dodaniu niekompetycyjnego inhibitora Vmax ulega zmianie, podczas gdy Km pozostaje niezmienione. Zgodnie ze spiskiem Lineweavera-Burka Vmax zmniejsza się podczas dodawania niekompetycyjnego inhibitora, co jest pokazane na wykresie jako zmiana zarówno nachylenia, jak i punktu przecięcia z osią y, gdy dodaje się niekonkurencyjny inhibitor.

Podstawowa różnica między konkurencyjnym i niekonkurencyjnym polega na tym, że konkurencyjne hamowanie wpływa na zdolność substratu do wiązania poprzez wiązanie inhibitora zamiast substratu, co obniża powinowactwo enzymu do substratu. W hamowaniu niekonkurencyjnym inhibitor wiąże się z miejscem allosterycznym i zapobiega przeprowadzeniu reakcji chemicznej przez kompleks enzym-substrat. Nie wpływa to na Km (powinowactwo) enzymu (do substratu). Hamowanie niekonkurencyjne różni się od hamowania niekonkurencyjnego tym, że nadal pozwala substratowi związać się z kompleksem enzym-inhibitor i utworzyć kompleks enzym-substrat-inhibitor, nie dotyczy to hamowania niekonkurencyjnego, zapobiega wiązaniu się substratu z enzymem inhibitor poprzez zmianę konformacji po wiązaniu allosterycznym.

Równanie

W obecności niekonkurencyjnego inhibitora widoczne powinowactwo do enzymu jest równoważne rzeczywistemu powinowactwu. Pod względem kinetyki Michaelisa-Mentena K m _app ⁼ K _m . Można to postrzegać jako konsekwencję zasady Le Chateliera, ponieważ inhibitor wiąże się jednakowo zarówno z enzymem, jak i kompleksem enzym-substrat, dzięki czemu równowaga jest zachowana. Ponieważ jednak pewien enzym jest zawsze powstrzymywany przed przekształceniem substratu w produkt, efektywne stężenie enzymu jest obniżone.

Matematycznie,

${\ Displaystyle V_ {max} ^ {aplikacja} = {\ Frac {V_ {max}} {1 + {\ Frac {[I] }{K_{I}}}}}}$

${\ Displaystyle {pozorny \ [E] _ {0}} = {\ Frac {[E] _ {0}} {1 + {\ Frac {[I]} {K_ {I}}}}}}$

Przykład: niekonkurencyjne inhibitory enzymu CYP2C9

Niekonkurencyjne inhibitory enzymu CYP2C9 obejmują nifedypinę , tranylcyprominę , izotiocyjanian fenetylu i 6-hydroksyflawon. Symulacja komputerowa dokowania i podstawione skonstruowane mutanty wskazują, że niekonkurencyjne miejsce wiązania 6-hydroksyflawonu jest zgłoszonym allosterycznym miejscem wiązania enzymu CYP2C9 .