Komórka muzyczna

Komórka Muse ( wieloliniowa , różnicująca , odporna na stres komórka) jest endogenną, nienowotworową, pluripotencjalną komórką macierzystą . Znajdują się w tkance łącznej prawie każdego narządu, w tym w pępowinie, szpiku kostnym i krwi obwodowej. Można je zbierać z komercyjnie dostępnych komórek mezenchymalnych, takich jak ludzkie fibroblasty , mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego i komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej. Komórki Muse są w stanie generować komórki reprezentatywne dla wszystkich trzech listków zarodkowych z pojedynczej komórki, zarówno spontanicznie, jak i poniżej indukcja cytokin . Ekspresja genów pluripotencji i różnicowanie triploblastyczne są samoodnawiające się przez pokolenia. Komórki Muse nie ulegają potworniaka po przeszczepie do środowiska gospodarza in vivo. Można to częściowo wytłumaczyć ich z natury niską telomerazy , eliminującą ryzyko powstawania nowotworów poprzez nieokiełznaną proliferację komórek. Zostały odkryte w 2010 roku przez Mari Dezawę i jej grupę badawczą. Badania kliniczne ostrego zawału mięśnia sercowego, udaru, pęcherzowego oddzielania się naskórka, uszkodzenia rdzenia kręgowego, stwardnienia zanikowego bocznego, zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) związanego z zakażeniem nowym koronawirusem (SARS-CoV-2) są prowadzone przez Life Science Institute, Inc. , spółka z grupy Mitsubishi Chemical Holdings firma. Rozpoczęto również prowadzone przez lekarzy badanie kliniczne dotyczące encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej u noworodków. Ogłoszono podsumowanie wyników randomizowanego, podwójnie ślepego, kontrolowanego placebo badania klinicznego u pacjentów po udarze mózgu.

Charakterystyka

Odporny na stres.
Nie wykazują rakotwórczości. Odporny na stresy genotoksyczne dzięki skutecznemu wykrywaniu uszkodzeń DNA i aktywacji systemów naprawy DNA.
Mogą być izolowane jako komórki dodatnie pod względem SSEA-3 , dobrze znanego markera ludzkich embrionalnych komórek macierzystych . Nie trzeba dodawać, że dodatnie SSEA-3 lub komórki Muse są świeże przez maksymalnie jeden dzień po sortowaniu, a jeśli na przykład posortujesz te same komórki po 5 dniach, zbierzesz tylko mniej więcej taki sam procent Muse lub pozytywnego sygnału, jaki uzyskałeś przed pierwszym sortowanie .
Pluripotencjalne komórki macierzyste, które mogą generować różne rodzaje komórek reprezentujących wszystkie trzy listki zarodkowe, mają zdolność samoodnawiania.
Nienowotworowe. Niska telomerazy .
Selektywnie gromadzą się w uszkodzonej tkance przez dożylne lub miejscowe wstrzyknięcia przez oś 2 receptora sfingozyno-1-fosforanu (S1P)-S1P.
Uzupełnij nowe funkcjonalne komórki poprzez spontaniczne różnicowanie się w komórki kompatybilne tkankowo po zasiedleniu uszkodzonej tkanki.
Napraw tkankę przez podawanie ogólnoustrojowe.
Obejmują ~ 0,03% przeszczepów szpiku kostnego i kilka% przeszczepów mezenchymalnych komórek macierzystych.
Mają działanie immunosupresyjne i immunomodulujące.
Pluripotencjalne komórki macierzyste można uzyskać bezpośrednio z normalnych tkanek ludzkich bez stosowania sztucznych manipulacji, takich jak wprowadzanie genów.
Komórki Donor-Muse mogą być bezpośrednio wykorzystane do leczenia bez testu dopasowania HLA lub leczenia immunosupresyjnego ze względu na swoisty przywilej immunologiczny.

Markery

Komórki Muse identyfikuje się jako komórki dodatnie pod względem SSEA-3 +, dobrze znanego markera dla niezróżnicowanych ludzkich komórek ES. Są również pozytywne dla ogólnych markerów mezenchymalnych komórek macierzystych, takich jak CD105 , CD90 i CD29 . Dlatego komórki Muse są podwójnie dodatnie pod względem markerów pluripotencjalnych i mezenchymalnych komórek macierzystych. Izolację komórek przez sortowanie komórek SSEA-3 można przeprowadzić przy użyciu przeciwciała SSEA-3. Ich rozmiar to 13 ~ 15 μm średnicy. Komórki muse nie wykazują ekspresji CD34 (markery hematopoetycznych komórek macierzystych , tłuszczowych komórek macierzystych, VSEL) i CD117 (markery hematopoetycznych komórek macierzystych), Snai1 i Slug (markery prekursorów pochodzenia skórnego), CD271 i Sox10 (markery komórek macierzystych pochodzących z grzebienia nerwowego), NG2 i CD146 ( komórki okołonaczyniowe ) lub CD31 i czynnik von Willebranda ( markery progenitorowe śródbłonka ) . Wskazuje to, że komórki Muse nie należą do wcześniej badanych typów komórek macierzystych.

Zdolność różnicowania

in vitro

Komórki muzowe mogą różnicować się w:

ektodermalne- (komórki dodatnie pod względem nestyny , NeuroD , Musashi, neurofilamentu , MAP-2 , markerów melanocytów ( tyrozynaza , MITF , gf100, TRP-1 , DCT )),
Mezodermalne- ( brachyury , Nkx2-5 , aktyna mięśni gładkich , osteokalcyna , czerwień olejowa-(+) kropelki lipidowe, desmina )
Linie endodermalne ( GATA-6 , α-fetoproteina , cytokeratyna -7, albumina ) zarówno spontanicznie, jak i pod wpływem cytokin.

Na żywo

Pokazano, że komórki muzy zagnieżdżają się w miejscu uszkodzenia przez oś receptora 2 S1P-S1P i spontanicznie różnicują się w komórki kompatybilne tkankowo zgodnie z mikrośrodowiskiem, aby przyczynić się do regeneracji tkanki po wlewie do krwioobiegu. Wykazano to w ludzkich komórkach Muse wprowadzonych do modeli zwierzęcych z piorunującym zapaleniem wątroby , częściową hepatektomią, zwyrodnieniem mięśni, pęcherzowym oddzielaniem się naskórka, uszkodzeniem skóry, udarem i uszkodzeniem rdzenia kręgowego .

Nierakotwórczość

Niska aktywność telomerazy

Komórki muse charakteryzują się niską aktywnością telomerazy, co nie jest silnym wskaźnikiem rakotwórczości. Komórki Hela i komórki iPS pochodzące z ludzkich fibroblastów wykazywały wysoką aktywność telomerazy, podczas gdy Muse była prawie na tym samym poziomie, co w komórkach somatycznych, takich jak fibroblasty (dane te przedstawiono bez bieżącej kontroli aktywności telomerazy, porównanie nie jest myślą naukową). Wskazuje to na nienowotworową naturę komórek Muse.

Ekspresja genów związanych z pluripotencją i cyklem komórkowym

„Wzorzec” ekspresji genów związanych z pluripotencją w komórkach Muse był prawie taki sam jak w komórkach ES i iPS, podczas gdy „poziom” ekspresji był znacznie wyższy w komórkach ES i iPS oraz w komórkach Muse. Natomiast geny związane z progresją cyklu komórkowego i rakotwórczością w komórkach Muse były na tym samym poziomie, co w komórkach somatycznych, podczas gdy te same geny były bardzo wysokie w komórkach ES i iPS. Ten wzorzec i poziom ekspresji genów może wyjaśniać, dlaczego komórki Muse są pluripotencjalne, ale bez aktywności rakotwórczej.

Transplantacja do jąder myszy

W przeciwieństwie do komórek ES i iPS, przeszczepione komórki Muse w jądrach myszy z niedoborem odporności - powszechnie stosowany eksperyment do testowania rakotwórczości komórek macierzystych - nie zostały zgłoszone jako potworniaki , nawet po sześciu miesiącach. Zatem komórki Muse są pluripotencjalne, ale nie powodują nowotworów. Podobnie komórki macierzyste epiblastów hodowane w określonych warunkach również nie tworzą potworniaków w jądrach, mimo że wykazują pluripotencję in vitro. Zatem pluripotencjalne komórki macierzyste nie zawsze wykazują powstawanie potworniaków po przeszczepieniu in vivo.

Naprawa tkanek

Komórki Muse działają in vivo jako komórki naprawiające tkanki . Po podaniu ogólnoustrojowym naiwne komórki Muse (bez leczenia cytokinami lub wprowadzania genów) migrują do uszkodzonego miejsca, wracają do miejsca i spontanicznie różnicują się w komórki kompatybilne tkankowo, aby uzupełnić nowe funkcjonalne komórki. Zjawisko to zaobserwowano poprzez infuzję naiwnych ludzkich komórek Muse znakowanych zieloną fluorescencją do modeli zwierzęcych z piorunującym zapaleniem wątroby , częściową resekcją wątroby, zwyrodnieniem mięśni, uszkodzeniem skóry, udarem i uszkodzeniem rdzenia kręgowego . Podane w infuzji komórki Muse zintegrowały się z każdą uszkodzoną tkanką i różnicowały się w ludzkie hepatocyty z ekspresją albuminy i ludzkiej antytrypsyny w wątrobie, ludzkie komórki z ekspresją dystrofiny w mięśniach, neurofilament i komórki neuronalne z ekspresją MAP-2 w rdzeniu kręgowym i mózgu , komórki naskórka eksprymujące desmogleinę-3, cytokerinę 14 i cytokeratynę 15 w skórze, komórki kłębuszków nerkowych, komórki nabłonka rogówki w rogówce i fizjologicznie funkcjonalne komórki serca w sercu.

Komórki Muse mają ogromne zalety w medycynie regeneracyjnej. Bez potrzeby indukcji cytokin lub sztucznej manipulacji genami, komórki Muse są zdolne do naprawy tkanek po bezpośrednim wlewie do krwioobiegu. Dlatego zastosowania kliniczne komórek Muse wydają się obiecujące. Dokładne warunki, takie jak liczba i źródło komórek Muse dla regeneracji każdego narządu, wymagają dalszych badań.

Obecnie Life Science Institute, Inc. i jego spółka macierzysta, Mitsubishi Chemical Holdings , ustanowiły procedurę przetwarzania komórek zgodną z japońską dobrą praktyką produkcyjną (GMP) oraz dobrą praktyką wytwarzania produktów opartych na genach, komórkach i tkankach ( rozporządzenie GCTP). Preparat z komórek Muse jest obecnie testowany w nieklinicznych badaniach toksyczności.

Podstawowe cechy

Pluripotencja, a mianowicie ekspresja pluripotentnego markera, różnicowanie triploblastyczne i samoodnawianie, są rozpoznawane w komórkach Muse pobranych bezpośrednio z aspiratów BM, co wskazuje, że ich cechy nie są nowo nabyte przez manipulację in vitro ani nie są modyfikowane w warunkach hodowli.

Lokalizacja na żywo

Komórki muse nie są generowane przez stres, indukcję cytokin lub transfekcję egzogennego genu. Są to istniejące wcześniej pluripotencjalne komórki macierzyste, które normalnie znajdują się w szpiku kostnym, krwi obwodowej i tkance łącznej każdego narządu, w tym pępowiny. [3][1][4][5][6] ] W szpiku kostnym stanowią jedną z 3000 komórek jednojądrzastych. Poza tkankami mezenchymalnymi komórki Muse lokalizują się w tkance łącznej każdego narządu oraz we krwi obwodowej.

Dwoistość

Komórki muse zachowują się jak komórki mezenchymalne w środowiskach przylegających, takich jak tkanka łączna i hodowla przylegająca , i przechodzą w zachowanie pluripotencjalne, gdy są przenoszone do środowiska zawiesiny, takiego jak krew i hodowla zawiesinowa

Tworzenie skupisk podobnych do zarodków komórek ES w zawiesinie

W zawiesinie komórkowej komórki Muse zaczynają się namnażać i tworzyć skupiska, które są bardzo podobne do ciał embrionalnych utworzonych z komórek ES w zawiesinie. Klastry komórek muzowych są dodatnie pod względem wskaźników pluripotencji, takich jak reaktywność fosfatazy alkalicznej , Nanog , Oct3/4 , Sox2 i PAR4 . Jedną z niezwykłych właściwości komórek Muse jest to, że są zdolne do tworzenia klastrów z pojedynczej komórki w zawiesinie. Wykazano, że pojedynczy klaster pochodzący z komórek Muse spontanicznie generuje komórki reprezentatywne dla wszystkich trzech listków zarodkowych na płytce pokrytej żelatyną, co dowodzi pluripotencji komórek Muse. Należy wspomnieć, że populacja niebędąca muzą również generuje klastry w tym samym stanie, ale w mniejszym procencie (50 muz vs 10 nie-muzy)

Szybkość proliferacji

Komórki Muse proliferują z prędkością ~ 1,3 dnia/podział komórki w hodowli adherentnej. Jest to nieco wolniejsze niż w przypadku ludzkich fibroblastów (~1 dzień/podział komórki).

Samoodnawianie

Komórki muse są zdolne do samoodnawiania, zachowując swoją aktywność proliferacyjną, ekspresję markerów pluripotencji i prawidłowy kariotyp.

Źródła

Komórki Muse można pobrać z aspiratu szpiku kostnego, którego pobieranie jest dobrze znaną procedurą wykonywaną codziennie w klinikach. Można je również izolować z fibroblastów skóry uzyskanych w wyniku biopsji skóry, tkanki tłuszczowej uzyskanej w drodze liposukcji oraz z pępowiny; bezpieczna i nieinwazyjna procedura często stosowana w chirurgii plastycznej. Łatwa dostępność komórek Muse pozwala na ich auto- lub alloprzeszczepy w regeneracyjnych zastosowaniach klinicznych. Komórki muse są również izolowane z dostępnych na rynku kultur komórek mezenchymalnych, co zapewnia ich dostępność i dostępność.

Źródła ogólne. Komórki Muse można uzyskać z:
- Aspirat szpiku kostnego
- Tkanka tłuszczowa i liposukcja
- skóra właściwa
- Pępowina
- Dostępne w handlu komórki hodowlane, takie jak:
  - Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego
  - Fibroblasty
  - Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej
Szpik kostny: Komórki jednojądrzaste szpiku kostnego zawierają ~0,03% podwójnie dodatnich komórek Muse SSEA-3/CD105. Ten stosunek odpowiada jednej na 3000 komórek jednojądrzastych.
Skóra właściwa: Komórki Muse, wykryte jako komórki SSEA-3-dodatnie, są rzadko zlokalizowane w tkance łącznej narządów. W skórze właściwej człowieka komórki Muse znajdują się w tkance łącznej rozmieszczonej w skórze właściwej i podskórnej. Ich lokalizacja nie jest związana z konkretnymi strukturami, takimi jak naczynia krwionośne czy brodawki skórne.
Tkanka tłuszczowa: Ostatnio komórki Muse zostały z powodzeniem wyizolowane z tkanki tłuszczowej i materiału liposukcji. Charakterystyka komórek Muse pochodzących z tkanki tłuszczowej była zgodna z cechami komórek Muse wyizolowanych z aspiratu szpiku kostnego i dostępnych w handlu fibroblastów. Chazenbalk i in. wykazało, że komórki Muse spontanicznie różnicowały się w komórki reprezentatywne dla wszystkich trzech listków zarodkowych.
Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego zawierają około 1% komórek Muse pozytywnych pod względem SSEA-3.
Ludzkie fibroblasty skóry zawierają około 1 do 5% komórek Muse dodatnich pod względem SSEA-3.
Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (Lonza Co.) zawierają około 1 do 7% komórek Muse pozytywnych pod względem SSEA-3.
Całkowity odsetek komórek Muse zależy od źródła tkanki mezenchymalnej, manipulacji i liczby komórek mezenchymalnych wykorzystanych do izolacji techniką hodowli komórkowej.
Komórki Muse u różnych gatunków: Większość badań nad komórkami Muse przeprowadzono na próbkach ludzkich. Ostatnio wyizolowano je z fibroblastów skóry koziej. Skupiska kozich SSEA3+ M wykazywały cechy morfologiczne podobne do komórek macierzystych i prawidłowy kariotyp . Ponadto były konsekwentnie dodatnie pod względem markerów pluripotencji i barwienia fosfatazą alkaliczną. Komórki Goat Muse wykazywały triploblastycznego zarówno in vivo, jak i in vitro i pozostawały niezróżnicowane przez osiem pasaży w hodowli zawiesinowej.

Metody zbierania

Komórki Muse można zbierać za pomocą kilku technik:

Sortowanie komórek : przy użyciu pojedynczego wyniku SSEA-3 lub podwójnego wyniku dodatniego SSEA-3/CD105, komórki Muse można izolować z tkanek i hodowanych komórek dostępnych w handlu. Gdy komórki Muse mają być pobierane bezpośrednio z tkanki, komórki są znakowane zarówno SSEA-3, jak i CD105. Jednak w przypadku hodowanych komórek mezenchymalnych prawie wszystkie komórki w MSC są dodatnie pod względem markerów mezenchymalnych, takich jak CD105 i CD90. Pojedyncze znakowanie SSEA-3 jest wystarczające do zebrania komórek Muse. Procedura obejmuje następujące kroki:

Przygotowanie komórek mezenchymalnych z fibroblastów skóry lub świeżych komórek jednojądrzastych pochodzących ze szpiku kostnego.
Izolacja komórek Muse metodą FACS jako komórek dodatnich pod względem SSEA-3.
Tworzenie klastrów M w hodowli zawiesinowej przy użyciu hodowli zawiesinowej pojedynczych komórek. Powierzchnia dna każdego naczynia hodowlanego lub studzienki musi być pokryta poli-HEMA, aby uniknąć adhezji komórek.

Długotrwałe traktowanie trypsyną (LTT) : W przypadku wykorzystania na dużą skalę komórek Muse – na przykład do eksperymentów transplantacyjnych – można je wzbogacić w komórki naiwne w warunkach silnego stresu komórkowego. Powstała populacja jest nazywana populacją komórek wzbogaconych w muzę (MEC). Najlepsze warunki do wzbogacenia Muse opisano jako długą inkubację trypsyną przez 16 godzin w fibroblastach skóry i długą inkubację trypsyną przez 8 godzin w mezenchymalnych komórkach macierzystych szpiku kostnego. Jednak praktyczną procedurą dla celów transplantacji lub różnicowania jest izolacja komórek Muse z masowej hodowli fibroblastów skóry lub MSC szpiku kostnego jako komórek dodatnich pod względem SSEA-3.
Ciężkie leczenie stresu komórkowego (SCST) : Komórki Muse można wyizolować z tłuszczu lipoaspirycznego poprzez poddanie działaniu silnych warunków stresowych, które eliminują wszystkie inne typy komórek z wyjątkiem komórek Muse, które przeżywają jako cecha ich zdolności do wytrzymałości na stres. Powstała populacja komórek zawiera dużą liczbę komórek Muse i dlatego nie ma potrzeby sortowania komórek. Uwzględniono warunki stresowe; długa inkubacja z kolagenazą, niska temperatura, niedobór surowicy i ciężkie niedotlenienie przez 16 godzin. Na koniec strawiony materiał odwirowuje się i osad ponownie zawiesza w PBS i inkubuje z buforem do lizy krwinek czerwonych. Stwierdzono, że komórki muz izolowane tą metodą stanowią populację odrębną od komórek macierzystych tkanki tłuszczowej.

Podstawowa różnica w stosunku do innych mezenchymalnych komórek macierzystych

Istnieją duże różnice między komórkami Muse i komórkami innymi niż Muse w populacji komórek mezenchymalnych. Kiedy komórki mezenchymalne (czasami nazywane mezenchymalnymi komórkami macierzystymi) są rozdzielane na komórki Muse i inne niż Muse przez sortowanie komórek SSEA-3, obserwuje się następujące różnice:

Komórki Muse, SSEA-3(+) tworzą skupiska (które są podobne do embrioidalnych ciałek komórek ES) z pojedynczej komórki w zawiesinie, podczas gdy komórki inne niż Muse, SSEA-3(-) nie rozmnażają się pomyślnie w zawiesinie i dlatego nie nie tworzą tych charakterystycznych skupisk.
Podstawowy poziom ekspresji genów pluripotencji w komórkach innych niż Muse jest bardzo niski lub niewykrywalny w porównaniu z komórkami Muse.
Komórki inne niż Muse nie wykazują regeneracji tkanek po wlewie do krwioobiegu. Chociaż nie integrują się z uszkodzoną tkanką, mogą pośrednio przyczyniać się do regeneracji tkanek poprzez produkcję cytokin, czynników troficznych i czynników przeciwzapalnych.

Komórki Muse jako główne źródło komórek iPS

W 2009 roku badanie wykazało, że tylko komórki SSEA-3+ generują indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) w ludzkich fibroblastach. W 2011 roku zasugerowano, że komórki iPS są generowane wyłącznie z komórek Muse. Kiedy technikę generowania komórek iPS zastosowano zarówno do komórek Muse, jak i innych niż Muse, komórki iPS zostały pomyślnie wygenerowane tylko z komórek Muse. W przeciwieństwie do tego, komórki inne niż Muse nie wykazywały podwyższenia w Sox2 i Nanog, głównych genach pluripotencjalnych komórek macierzystych, nawet po otrzymaniu czterech czynników Yamanaka. Wyniki te wspierają elitarny model generowania komórek iPS, a nie model stochastyczny. Odbiegające od pochodzenia komórek Muse, komórki iPS wykazywały rakotwórczość. Ponieważ komórki Muse są pierwotnie pluripotentne bez aktywności rakotwórczej, czynniki Yamanaka nowo nadane komórkom Muse nie były „pluripotencją”, ale aktywnością rakotwórczą. Wyniki te łącznie sugerują, że tylko istniejące wcześniej komórki o obiecującej pluripotencji można zaprogramować w komórkach iPS.

Zdolność różnicowania komórek Muse in vitro

Komórki Muse z różnych źródeł są zdolne do różnicowania in vitro w różne typy komórek.

melanocyty:

Komórki Muse pochodzące z ludzkich fibroblastów skóry są praktycznym źródłem indukcji melanocytów. Zastosowanie systemu indukcji cytokin zawierającego Wnt3a, SCF, ET-3, zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów, kwas linolowy, toksynę cholery, kwas L-askorbinowy, 13-octan 12-O-tetradekanoiloforbolu, insulinę, transferynę, selen i deksametazon zarówno Komórki Muse i inne niż Muse pochodzące z ludzkich fibroblastów skóry indukują tylko komórki Muse do funkcjonalnych melanocytów reagujących na L-DOPA, zdolnych do produkcji melaniny w hodowanym modelu skóry 3D. Zastosowanie zestawu cytokin różnicuje również komórki dermal-Muse w melanocyty.

keratynocyty

Komórki Muse pochodzące z ludzkiej tkanki tłuszczowej różnicują się w keratynocyty przez spontaniczne różnicowanie na płytce do hodowli żelatynowej lub przez indukcję cytokin zawierających białko morfogenetyczne kości-4 i cały kwas trans -retinowy.

Komórki neuronalne:

Ludzkie komórki Muse pochodzące ze szpiku kostnego i fibroblastów spontanicznie różnicują się w komórki linii nerwowej z mniejszą proporcją w hodowli żelatynowej. Komórki rozszerzone z pojedynczych klastrów pochodzących z komórek Muse na płytkach hodowlanych pokrytych żelatyną wyrażają markery neuronowe nestynę (1,9%), MAP-2 (3,8%), GFAP (3,4%) i O4 (2,9%), co sugeruje zdolność Komórki Muse różnicują się w komórki linii neuronowej. Komórki dodatnie pod względem MAP-2 lub GFAP rosły po indukcji podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów, forskoliną i rzęskowym czynnikiem neurotroficznym.

Komórki wątroby:

Komórki Muse mogą spontanicznie różnicować się in vitro w komórki linii hepatocytów dodatnie pod względem DLK, alfa-fetoproteiny, cytokeratyny 19 i cytokeratyny 18 na płytkach hodowlanych pokrytych żelatyną. W obecności insuliny-transferyny-selenu, deksametazonu, czynnika wzrostu hepatocytów i czynnika wzrostu fibroblastów-4, komórki Muse różnicują się w komórki alfa-fetoproteiny(+), albuminy(+).

Komórki kłębuszkowe:

Komórki Muse różnicują się in vitro w komórki linii nerkowej ze zwiększoną ekspresją rozwojowych markerów nerkowych WT1 i EYA1 w porównaniu z komórkami innymi niż Muse po 3 tygodniach po zastosowaniu koktajlu indukującego cytokiny zawierającego cały kwas trans-retinowy, aktywinę A i białko morfologiczne kości -7.

Komórki serca:

Traktowanie komórek Muse 5'-azacytydyną w hodowli zawiesinowej; następnie przeniesienie komórek do hodowli adherentnej i potraktowanie czynnikami wczesnego różnicowania serca bezskrzydłym-int (Wnt)-3a, białkami morfogenetycznymi kości (BMP)-2/4 i transformującym czynnikiem wzrostu (TGF) b1; dalsze traktowanie cytokinami późnego różnicowania sercowego, w tym komórkami Muse przekształconymi kardiotrofiną-1 w komórki podobne do kardiomiocytów, które eksprymowały α-aktyninę i troponinę-I ze wzorem przypominającym prążkowanie.

Adipocyty i Osteocyty:

Rozszerzone komórki z klastrów Muse różnicują się w adipocyty pod wpływem 1-metylo-3-izobutyloksantyny, deksametazonu, insuliny i indometacyny. Te indukowane adipocyty zawierają kropelki lipidów i wybarwiają się pozytywnie pod kątem czerwieni olejowej O. Ponadto, rozszerzone komórki klastra Muse różnicują się w osteoblasty dodatnie pod względem osteokalcyny przy użyciu deksametazonu, kwasu askorbinowego i β-glicerofosforanu.

in vivo komórek Muse

Komórki Muse z różnych źródeł wykazują działanie naprawcze w modelach chorób zwierzęcych.

Model ostrego zawału mięśnia sercowego

Królicze autoprzeszczepy, alloprzeszczepy i ksenoprzeszczepy (ludzkie) komórki Muse szpiku kostnego podawano dożylnie w króliczym modelu ostrego zawału mięśnia sercowego. Dynamika in vivo komórek Muse wykazała preferencyjne zasiedlanie komórek do serca po zawale po 3 dniach i 2 tygodniach, przy czym szacuje się, że około 14,5% wstrzykniętych komórek Muse zostało wszczepionych do serca po 3 dniach. Wykazano, że migracja i zasiedlanie komórek Muse odbywa się za pośrednictwem osi S1P (monofosforan sfingozyny) - S1PR2. Po zasiedleniu komórki Muse spontanicznie różnicowały się w komórki dodatnie pod względem markerów sercowych, takich jak sercowa troponina-I, sarkomeryczna α-aktynina i koneksyna-43 oraz markery naczyniowe, a komórki Muse znakowane GCaMP3, które wszczepiły się w region niedokrwienny wykazywały zwiększony poziom GCaMP3 fluorescencji podczas skurczu i zmniejszonej fluorescencji podczas rozkurczu, co sugeruje ich funkcjonalność jako pracujących kardiomiocytów. Rozmiar zawału zmniejszył się o ≈52%, a frakcja wyrzutowa wzrosła o ≈38% w porównaniu z wstrzyknięciem nośnika po 2 miesiącach, odpowiednio ≈2,5 i ≈2,1 razy więcej niż indukowane przez mezenchymalne komórki macierzyste. Alloprzeszczepy i ksenoprzeszczepy komórek Muse skutecznie wszczepiły i odzyskały funkcje, a alloprzeszczepy pozostały w tkance i trwały powrót do funkcji przez okres do 6 miesięcy bez immunosupresji.

Modele udaru i krwotoku śródmózgowego:

Zdolność komórek Muse do regeneracji neuronów została wykazana w kilku modelach. W modelu udaru u szczurów wywołanym reperfuzją niedokrwienną zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO), 3 x 10 ⁴ ludzkich komórek skórnych Muse wstrzyknięto miejscowo w trzy miejsca w obszarze zawału (każde miejsce otrzymało 1 x 10 ⁴ Komórki Muse) zapewniły statystycznie istotną poprawę funkcjonalną w porównaniu z grupami, którym wstrzyknięto nośnik i fibroblasty inne niż Muse, po ~2,5 miesiąca. Odzyskiwanie funkcji było wspierane przez włączenie ludzkich komórek Muse do piramidalnych i czuciowych dróg szczura ze znormalizowanymi wywołanymi potencjałami somatosensorycznymi kończyn tylnych. Podobnie, miejscowo wstrzyknięte ludzkie komórki szpiku kostnego-Muse integrują się z regionem zawału i uzupełniają nowe komórki neuronalne i oligodendrocyty w mysich modelach trwałego MCAO i mysiego udaru lakunarnego. W mysim modelu udaru lakunarnego, komórki nerwowe pochodzące z ludzkich komórek Muse zintegrowały się z układem piramidowym, prowadząc do statystycznie znaczącej poprawy funkcjonalnej. W mysim modelu krwotoku śródmózgowego, wstrzyknięte miejscowo ludzkie komórki Muse szpiku kostnego spontanicznie różnicują się w komórki nerwowe. Myszy odzyskały funkcje motoryczne oraz zdolność uczenia się przestrzennego i zapamiętywania.

Modele marskości wątroby i częściowej hepatektomii:

Dożylnie wstrzyknięte ludzkie komórki Muse pochodzące ze szpiku kostnego są w stanie naprawić mysi model marskości wątroby wywołanej przez CCL4 z niedoborem odporności (SCID). Komórki Human Muse spontanicznie różnicują się in vivo do hepatocytów bez fuzji z hepatocytami gospodarza i eksprymują dojrzałe funkcjonalne markery, takie jak ludzki CYP1A2 (enzym detoksykacyjny) i ludzka Glc-6-Paza (enzym odpowiedzialny za metabolizm glukozy) w 8 tygodni po zasiedleniu. Ludzkie komórki Muse pochodzące ze szpiku kostnego wstrzyknięte dożylnie do modelu częściowej hepatektomii u myszy SCID różnicują się spontanicznie w główne składniki wątroby, mianowicie hepatocyty (74,3% zintegrowanych komórek Muse z dodatnim wynikiem zielonej fluorescencji), cholangiocyty (17,7%), sinusoidalne komórki śródbłonka ( 2,0%) i komórki Kupffera (6,0%) po migracji i zasiedleniu do uszkodzonej wątroby. MSC szpiku kostnego innego niż Muse nie są wykrywane w wątrobie od wczesnego stadium (~ 1 tydzień) do punktu końcowego w żadnym modelu.

Model przewlekłej choroby nerek:

Ludzkie komórki Muse pochodzące ze szpiku kostnego wstrzyknięte dożylnie naprawiają mysie modele SCID i BALB/c ogniskowego segmentalnego stwardnienia kłębuszków nerkowych bez dodatkowej immunosupresji. Wstrzyknięte ludzkie komórki Muse preferencyjnie integrują się z uszkodzonymi kłębuszkami nerkowymi i spontanicznie różnicują się w komórki wykazujące ekspresję markerów podocytów (podocyna; ~31%), komórek mezangialnych (megsyna; ~13%) i komórek śródbłonka (CD31; ~41%) bez fuzji z komórki kłębuszkowe gospodarza; złagodzić stwardnienie kłębuszków nerkowych i zwłóknienie śródmiąższowe; i indukują powrót czynności nerek, w tym klirensu kreatyniny.

Owrzodzenia skóry w cukrzycy:

Komórki bogate w muzę pochodzące z ludzkiej tkanki tłuszczowej znacznie przyspieszają gojenie się ran w owrzodzeniach skóry modelu myszy z cukrzycą typu 1. Wstrzyknięte podskórnie ludzkie komórki Muse integrują się z naskórkiem i skórą właściwą i różnicują się w keratynocyty, komórki śródbłonka naczyń i inne typy komórek w skórze właściwej. Wrzody leczone ludzkimi komórkami Muse goją się szybciej z grubą warstwą naskórka niż te leczone komórkami innymi niż Muse, a czas zamykania rany jest nawet krótszy niż u myszy typu dzikiego.

Model tętniaka aorty:

Oceniono skuteczność terapeutyczną dożylnego wstrzyknięcia ludzkich komórek Muse szpiku kostnego do mysiego modelu tętniaka aorty SCID. Po 8 tygodniach infuzja ludzkich komórek Muse osłabiła rozszerzenie tętniaka, a wielkość tętniaka w grupie Muse odpowiadała około 45,6% w grupie otrzymującej nośnik. Wykazano, że komórki Muse poddane infuzji migrują do tkanki tętniaka od strony przydankowej i penetrują w kierunku strony światła. Analiza histologiczna wykazała silne zachowanie elastycznych włókien i spontaniczne różnicowanie komórek Muse w komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich naczyń.

Model pęcherzowego oddzielania się naskórka

Myszy z nokautem (KO) kolagenu typu XVII (Col17), które symulują łączne EB i nawracające uszkodzenia skóry, otrzymały 5, 0 × 10^ 4 ludzkich komórek Muse lub ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych innych niż Muse (MSC) przez wstrzyknięcie dożylne do żyły ogonowej. Obrazowanie ex vivo wypreparowanej uszkodzonej skóry potwierdziło zasiedlenie wstrzykniętych komórek Muse, ale nie komórek innych niż Muse-MSC. Ludzkie komórki Muse zagnieżdżone w naskórku myszy wyrażały keratynę 14 i ludzką desmogleinę-3. Warto zauważyć, że wszystkie myszy z grupy Muse wykazywały liniowe odkładanie się ludzkiego typu VII COL (hCOL7) w miejscu urazu skóry myszy, gdzie komórki pochodzące z Muse były intensywnie zintegrowane. Podobnie cztery z pięciu myszy w grupie Muse wykazały odkładanie się ludzkiego COL17 w połączeniu z komórkami podstawnymi pochodzącymi z komórek Muse.

model encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków

Siedmiodniowe szczury poddano podwiązaniu lewej tętnicy szyjnej, a następnie wystawiono na działanie 8% tlenu przez 60 minut, a 72 godziny później przeszczepiono im dożylnie 1 × 104 ludzkich komórek Muse i innych niż Muse, pobranych z kości mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego jako swoisty dla danego stadium embrionalny antygen-3 (SSEA-3)+ i - odpowiednio, lub sól fizjologiczna (nośnik) bez immunosupresji. Komórki Muse rozprzestrzeniły się głównie do uszkodzonego mózgu po 2 i 4 tygodniach i wyrażały markery neuronalne i glejowe do 6 miesięcy. W przeciwieństwie do tego, komórki inne niż Muse utkwiły w płucach po 2 tygodniach, ale były niewykrywalne po 4 tygodniach. Spektroskopia rezonansu magnetycznego i pozytonowa tomografia emisyjna wykazały, że komórki Muse tłumią ekscytotoksyczne metabolity glutaminergiczne w mózgu i hamują aktywację mikrogleju. Grupa leczona komórkami Muse wykazała znaczną poprawę funkcji motorycznych i poznawczych po 4 tygodniach i 5 miesiącach. Dożylnie przeszczepione komórki Muse przyniosły korzyści funkcjonalne w eksperymentalnym HIE, prawdopodobnie poprzez regulację metabolizmu glutaminianu i zmniejszenie aktywacji mikrogleju.

Model stwardnienia zanikowego bocznego

U myszy transgenicznych ALS G93A, dożylne wstrzyknięcie 5,0 × 10^4 komórek Muse ujawniło udane naprowadzanie do rdzenia kręgowego odcinka lędźwiowego, głównie w oponie miękkiej i pod istotą białą, i wykazywało morfologię podobną do gleju i ekspresję GFAP. W przeciwieństwie do tego, takie zasiedlanie lub różnicowanie nie zostało rozpoznane w ludzkich mezenchymalnych komórkach macierzystych, ale zamiast tego było rozmieszczone głównie w płucach. W porównaniu z grupami nośników, grupa Muse znacznie poprawiła wyniki w rotarod, podwieszaniu drutu i sile mięśni kończyn dolnych, odzyskała liczbę neuronów ruchowych oraz złagodziła odnerwienie i zanik włókien mięśniowych w mięśniach kończyn dolnych. Wyniki te sugerują, że komórki Muse zadomowiły się w sposób zależny od miejsca uszkodzenia i chroniły rdzeń kręgowy przed śmiercią neuronu ruchowego.

Model encefalopatii związanej z E. coli wytwarzającej Stx2

Escherichia coli wytwarzająca toksynę Shiga (STEC) powoduje krwotoczne zapalenie jelita grubego, zespół hemolityczno-mocznicowy i ostre encefalopatie, które mogą prowadzić do nagłej śmierci lub poważnych następstw neurologicznych. Myszy z poważnym upośledzeniem odporności, nieotyłe z cukrzycą / ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD-SCID), zaszczepione doustnie 9 × 10 ^ 9 jednostek tworzących kolonie STEC O111 i leczone 48 godzin później dożylnym wstrzyknięciem 5 × 10 ^ 4 Komórki Muse wykazywały 100% przeżycie i brak poważnych następstw infekcji. Tłumienie czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF) przez RNAi zniosło korzystne działanie komórek Muse, prowadząc do 40% śmierci i znacznej utraty masy ciała, co sugeruje udział G-CSF w korzystnym działaniu komórek Muse w Myszy zakażone STEC. Zatem dożylne podawanie komórek Muse może być potencjalnym podejściem terapeutycznym do zapobiegania śmiertelnej encefalopatii po zakażeniu STEC.

Bliznowacenie rogówki

Ludzkie komórki Muse, pobrane z lipoaspiratu, aktywowano poprzez utworzenie sferoidy w systemie dynamicznej hodowli komórkowej rotacyjnej . Te aktywowane sferoidy Muse umożliwiły łatwe różnicowanie w komórki zrębu rogówki (CSC) wykazujące ekspresję charakterystycznych genów markerowych i białek in vitro. Wszczepienie zróżnicowanych CSC komórek Muse (Muse-CSC) obciążonych z dwoma prostopadle ułożonymi, ułożonymi w stos, rozciągniętym skompresowanym kolagenem (komórka-SCC) w rogówkach myszy i ryjówki drzewiastej zapobiegło tworzeniu się blizn rogówki, zwiększonej ponownej epitelializacji rogówki i odrastaniu nerwów oraz zmniejsza nasilenie zapalenia rogówki i neowaskularyzacji. komórka-SCC zachowała zdolność do tłumienia bliznowacenia rogówki po transporcie kriokonserwowanym na duże odległości.

Komórki Muse w danych klinicznych

Komórki muse są obecne w ludzkim szpiku kostnym zdrowych dawców. Liczba komórek muzy krwi obwodowej jest drastycznie zwiększona u pacjentów z udarem 24 godziny po wystąpieniu udaru. U pacjentów z ostrym zawałem mięśnia sercowego liczba komórek muz krwi obwodowej znacznie wzrasta po 24 godzinach od wystąpienia, czemu towarzyszy wzrost stężenia sfingozyno-1-fosforanu w surowicy i powraca do poziomu wyjściowego po 2–3 tygodniach. Co ważne, pacjenci ze zwiększoną liczbą komórek Muse krwi obwodowej w ostrej fazie wykazują powrót funkcji serca i unikanie niewydolności serca po 6 miesiącach od wystąpienia, co sugeruje funkcję naprawczą endogennych komórek Muse.

Medycyna regeneracyjna

Przeszczep szpiku kostnego: Komórki Muse to subpopulacja komórek szpiku kostnego. Stanowią one niewielką populację jednojądrzastych komórek szpiku kostnego (~0,03%). Oznacza to, że już wielokrotnie dostarczano je pacjentom na całym świecie w ramach przeszczepów szpiku kostnego; znany zabieg wykonywany w klinikach od 1958 roku.
Przeszczep mezenchymalnych komórek macierzystych: Komórki Muse istnieją w hodowanych MSC, takich jak mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego i komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej. Przeszczep MSC został zastosowany do naprawy wątroby, serca, tkanki nerwowej, dróg oddechowych, skóry, mięśni szkieletowych i jelit. Dlatego też, jeśli komórki Muse zostały oczyszczone lub wzbogacone, oczekuje się, że skuteczność obecnie wykonywanego przeszczepu MSC ulegnie znacznej poprawie.
Ponieważ komórki Muse nie tworzą potworniaków in vivo, mogą stanowić idealne źródło pluripotencjalnych komórek macierzystych dla medycyny regeneracyjnej i terapii komórkowej .

Badanie kliniczne

Obecnie Life Science Institute, Inc. i jego spółka macierzysta, Mitsubishi Chemical Holdings , ustanowiły procedurę przetwarzania komórek zgodną z japońską dobrą praktyką produkcyjną (GMP) oraz dobrą praktyką wytwarzania produktów opartych na genach, komórkach i tkankach ( rozporządzenie GCTP). W 2018 r. rozpoczęto badania kliniczne produktu CL2020 na bazie ludzkich komórek Muse, ukierunkowanego na ostry zawał mięśnia sercowego, udar , pęcherzowe oddzielanie się naskórka , uszkodzenie rdzenia kręgowego , stwardnienie zanikowe boczne i zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) związane z zakażeniem nowym koronawirusem (SARS-CoV-2).
Opublikowano szybkie komunikaty dotyczące ostrego zawału mięśnia sercowego i pęcherzowego oddzielania się naskórka.
Ogłoszono podsumowanie wyników randomizowanego, podwójnie ślepego, kontrolowanego placebo badania klinicznego u pacjentów po udarze mózgu. Pierwszorzędowym punktem końcowym badania klinicznego było bezpieczeństwo pacjenta do 52 tygodni po podaniu CL2020 i nie zaobserwowano żadnych działań niepożądanych, które uniemożliwiłyby postęp badania klinicznego przez cały okres badania klinicznego. Przed podaniem placebo lub CL2020 większość pacjentów miała punktację w zmodyfikowanej skali Rankina (mRS1) wynoszącą 4 (umiarkowanie ciężka niesprawność: niezdolność do chodzenia i wykonywania czynności życiowych bez pomocy) lub 5 (ciężka niepełnosprawność: przykucie do łóżka, nietrzymanie moczu i konieczność ciągła opieka i uwaga). Po 52 tygodniach od podania odsetek pacjentów z odpowiedzią na leczenie w grupie CL2020 wynosił 68,2% (15/22 przypadków), a różnica między grupą CL2020 a grupą placebo (37,5%, 3/8 przypadków) utrzymywała się na poziomie ponad 30 %.Ocena skuteczności po 52 tygodniach od podania wykazała, że 7 z 22 (31,8%) osób w grupie CL2020 uzyskało wynik mRS równy 1 (brak znacznej niepełnosprawności pomimo objawów: zdolność do wykonywania wszystkich czynności przed udarem bez pomocy, jak powrót do pracy). Nikt w grupie placebo nie osiągnął wyniku mRS równego 1 w ciągu 52 tygodni.

Zobacz też