Królicza hybrydoma
Królicza hybrydoma przeciwciała jest hybrydową linią komórkową utworzoną przez fuzję króliczej komórki B wytwarzającej z nowotworową komórką B ( szpiczak ).
Historia
Udokumentowano, że układ odpornościowy królika jest nośnikiem do opracowywania przeciwciał o wyższym powinowactwie i bardziej zróżnicowanym rozpoznawaniu wielu cząsteczek, w tym fosfopeptydów, węglowodanów i immunogenów, które w inny sposób nie są immunogenne u myszy. Jednak do niedawna rodzaj przeciwciał dostępnych u królików był ograniczony do przeciwciał poliklonalnych . Po opracowaniu technologii mysiej hybrydomy podjęto szereg wysiłków w celu wytworzenia króliczych przeciwciał monoklonalnych W latach siedemdziesiątych. Przeprowadzono badania na heterohybrydomach myszy i królików w celu wytworzenia króliczych przeciwciał monoklonalnych. Jednak te heterohybrydomy były ostatecznie trudne do sklonowania, a klony były generalnie niestabilne i nie wydzielały przeciwciał przez dłuższy czas.
Początkowy partner fuzyjny
W 1995 roku Katherine Knight i jej współpracownikom z Loyola University of Chicago udało się opracować podwójnie transgenicznego królika z nadekspresją onkogenów v-abl i c-myc pod kontrolą wzmacniaczy łańcucha ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny. Królik utworzył nowotwór podobny do szpiczaka, co umożliwiło wyizolowanie linii komórkowej plazmocytomy, nazwanej 240E-1. Fuzja komórek 240E-1 z limfocytami króliczymi dała hybrydoma, które w spójny sposób wydzielały królicze przeciwciała monoklonalne. Jednakże, podobnie jak w przypadku wczesnych mysich linii szpiczaka opracowanych w latach 70., problemem była stabilność. Szereg laboratoriów, które otrzymały linię komórkową 240E-1 z laboratorium dr Knighta, zgłosiło problemy ze stabilnością fuzji komórkowej linii 240E-1.
Ulepszony partner fuzyjny
W 1996 roku Weimin Zhu i Robert Pytela z Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco (UCSF) uzyskali 240E-1 z laboratorium dr Knighta i podjęli próbę opracowania ulepszonej króliczej hybrydomy. Ulepszenia właściwości 240E-1 osiągnięto poprzez wielokrotne subklonowanie, selekcję pod kątem wysokiej wydajności fuzji, silnego wzrostu i cech morfologicznych, takich jak jasny wygląd pod mikroskopem z kontrastem fazowym . Wybrane subklony były dalej testowane pod kątem ich zdolności do wytwarzania stabilnej hybrydomy i wydzielania przeciwciał monoklonalnych. Po wielu rundach procesów subklonowania i selekcji zidentyfikowano nową linię komórkową o nazwie 240E-W, która charakteryzowała się lepszą wydajnością i stabilnością fuzji. Od tego czasu linia komórkowa 240E-W była dalej rozwijana i optymalizowana pod kątem produkcji króliczych przeciwciał monoklonalnych do zastosowań badawczych i komercyjnych.
Proces
Proces tworzenia hybrydomy u królika polega najpierw na uzyskaniu komórek B od królika, który został immunizowany. Istnieje wiele protokołów immunizacji królików, w szczególności dotyczących wytwarzania przeciwciał poliklonalnych. Po immunizacji komórki B poddaje się fuzji z kandydującą linią komórkową partnera fuzyjnego królika, tworząc hybrydomy. Powstałe przeciwciała z hybrydom są przeszukiwane pod kątem antygenu, który spełnia kryteria zainteresowania, za pomocą testów diagnostycznych, takich jak ELISA , Western blot , immunohistochemia i FACS. Powstałe hybrdomy można subklonować w celu zapewnienia właściwości monoklonalnych.
Humanizacja przeciwciał króliczych
Mitchell Ho i Ira Pastan z National Cancer Institute (Bethesda, USA) wyizolowali grupę króliczych przeciwciał monoklonalnych (np. YP218, YP223), które rozpoznają rzadkie epitopy mezoteliny, w tym słabo immunogenne miejsca blisko końca C, do terapii przeciwnowotworowej. Laboratorium dr Ho przeanalizowało złożone struktury króliczych przeciwciał wraz z ich antygenami z Protein Data Bank i zidentyfikowało reszty mające kontakt z antygenem na króliczym Fv w odległości 6 angstremów od jego antygenu. Nazwali „HV4” i „LV4”, pętle regionów nie determinujących komplementarności (CDR), które są strukturalnie zbliżone do antygenu i zlokalizowane w zrębie 3 odpowiednio łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego królika. Na podstawie analizy strukturalnej zaprojektowali strategię humanizacji poprzez wszczepienie połączonych CDR Kabata/IMGT/Paratome do sekwencji zrębowej ludzkiej linii zarodkowej. Immunotoksyny złożone z humanizowanych króliczych Fv (np. hYP218) połączonych z klinicznie stosowaną toksyną wykazywały silniejszą cytotoksyczność wobec komórek nowotworowych niż immunotoksyny pochodzące z ich oryginalnych króliczych Fv. Limfocyty T CAR oparte na przeciwciałach hYP218 wykazują skuteczne hamowanie wzrostu guza u myszy. Sposób (tj. przeszczepienie połączonych króliczych CDR Kabat/IMGT/Paratome do stabilnego zrębu ludzkiej linii zarodkowej) sugerowano jako ogólne podejście do humanizowania króliczych przeciwciał.
Linki zewnętrzne
- Spieker-Polet H, Sethupathi P, Yam PC, Rycerz KL (wrzesień 1995). „Królicze przeciwciała monoklonalne: generowanie partnera fuzyjnego do produkcji hybrydom królik-królik” . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 92 (20): 9348–52. Bibcode : 1995PNAS...92.9348S . doi : 10.1073/pnas.92.20.9348 . JSTOR 2368468 . PMC40982 . _ PMID 7568130 .
- Notenboom RH, Chou CT, Good PW, Dubiski S, Cinader B, Köhler G (październik 1980). „Izolacja i charakterystyka hybrydomy mysz-królik”. Journal of Immunogenetics . 7 (5): 359–68. doi : 10.1111/j.1744-313X.1980.tb00729.x . PMID 7430676 . S2CID 39872636 .
- Rossi S, Laurino L, Furlanetto A, Chinellato S, Orvieto E, Canal F i in. (sierpień 2005). „Królicze przeciwciała monoklonalne: badanie porównawcze między nową kategorią immunoreagentów a odpowiednimi mysimi przeciwciałami monoklonalnymi” . American Journal of Clinical Pathology . 124 (2): 295–302. doi : 10.1309/NR8H-N08G-DPVE-MU08 . PMID 16040303 .