Liza alkaliczna
Liza alkaliczna lub ekstrakcja alkaliczna to metoda stosowana w biologii molekularnej do izolowania plazmidowego DNA z bakterii.
metoda
Bakterie zawierające plazmid będący przedmiotem zainteresowania są najpierw hodowane , a następnie próbka jest wirowana w celu zatężenia materiału komórkowego (w tym DNA ) w osadzie na dnie naczynia zawierającego. Supernatant odrzuca się, a następnie osad ponownie zawiesza w buforze fizjologicznym zawierającym EDTA . Zadaniem EDTA jest chelatowanie kationów metali dwuwartościowych, takich jak Mg 2+ i Ca 2+ , które są niezbędne do funkcjonowania enzymów rozkładających DNA ( DNAz ) oraz służą do destabilizacji szkieletu fosforanowego DNA i ściany komórkowej. Glukoza w buforze utrzyma ciśnienie osmotyczne komórki, aby zapobiec pęknięciu komórki. Tris w buforze utrzyma pH komórki na poziomie 8,0, a RNaza usunie RNA, co zakłóci eksperyment.
przygotowuje się i dodaje silnie alkaliczny roztwór składający się z detergentu dodecylosiarczanu sodu (SDS) i mocnej zasady, takiej jak wodorotlenek sodu (NaOH). Otrzymaną mieszaninę inkubuje się przez kilka minut. W tym czasie detergent rozrywa błony komórkowe i umożliwia alkaliom kontakt i denaturację zarówno chromosomalnego , jak i plazmidowego DNA. Po rozerwaniu błony komórkowej przez SDS zawartość komórek zneutralizuje NaOH; dlatego pH lizy spada z 12,8 do 12,3. Więc jeśli nie ma wystarczającej liczby komórek bakteryjnych, dodatkowy NaOH będzie generował małe fragmenty DNA. Ale 0,5 M L-argininy, która zapewnia stabilne pH, może zastąpić 0,1 M wodorotlenek sodu.
Na koniec dodaje się octan potasu . To zakwasza roztwór i umożliwia renaturację plazmidowego DNA, ale nie chromosomalnego DNA, które wytrąca się z roztworu. Inną funkcją potasu jest powodowanie wytrącania dodecylosiarczanu sodu , a tym samym usuwanie detergentu. Przeprowadzane jest końcowe wirowanie i tym razem osad zawiera tylko resztki i może zostać wyrzucony. Supernatant zawierający plazmid jest ostrożnie usuwany i może być dalej oczyszczany lub używany do analizy, takiej jak elektroforeza żelowa .
Inne zastosowania
Ponadto liza alkaliczna jest czasami stosowana do ekstrakcji materiału genetycznego roślin. Komórki roślinne poddaje się działaniu silnie alkalicznego roztworu zawierającego detergent (zwykle detergent obojniaczojonowy lub niejonowy , taki jak Tween 20 ) i mieszaninę inkubuje się w wysokiej temperaturze. Ta metoda nie jest tak często stosowana ze względu na tendencję wodorotlenku sodu do uszkadzania materiału genetycznego, zmniejszając rozmiar fragmentu DNA.
- Liza alkaliczna w kuchni molekularnej Mama Ji
- Birnboim HC, Doly J (listopad 1979). „Procedura szybkiej ekstrakcji alkalicznej do przeszukiwania rekombinowanego plazmidowego DNA” . Kwasy nukleinowe Res . 7 (6): 1513–23. doi : 10.1093/nar/7.6.1513 . PMC 342324 . PMID 388356 .