MAGICZNY

Multipleksowana dokładna edycja genomu z krótkimi, możliwymi do śledzenia, zintegrowanymi komórkowymi kodami kreskowymi ( MAGESTIC ) to platforma, która opiera się na technice CRISPR /Cas. Ponadto poprawia CRISPR/Cas, zwiększając precyzję procesu edycji genów. Zwiększa również przeżywalność komórek podczas procesu edycji nawet siedmiokrotnie.

Technologia ta została wynaleziona w Stanford Genome Technology Center we współpracy z Joint Initiative for Metrology in Biology (JIMB), która jest koalicją Uniwersytetu Stanforda i Narodowego Instytutu Standardów i Technologii .

Przegląd

Edycja genów jest wykorzystywana do różnych zadań, w tym do modyfikowania upraw, modyfikowania bakterii i modyfikowania chorobotwórczych mutacji genetycznych u pacjentów . Gdy wymagana jest tylko pojedyncza edytowana linia komórkowa, CRISPR/Cas w połączeniu z endogenną wydajnością naprawy DNA jest wystarczająca do uzyskania edytowanej linii komórkowej. Jednak przy próbie wprowadzenia wielu zmian w multipleksie, wyższa skuteczność naprawy ukierunkowanej na homologację jest wymagane. Technologia MAGESTIC składa się z wielu elementów. Jeden składnik, białko LexA-Fkh1, bierze udział w procesie rekrutacji dawców, który zwiększa efektywność naprawy ukierunkowanej na homologię. Drugim składnikiem jest biblioteka przewodników RNA CRISPR sparowanych z DNA dawcy, który koduje określoną edycję, która ma zostać zintegrowana poprzez naprawę ukierunkowaną na homologię. To z kolei jest powiązane z kodami kreskowymi DNA , które umożliwiają śledzenie określonych wariantów w pulach, podobnie jak ekrany nokautowe CRISPR-Cas9 całego genomu tylko MAGESTIC jest bardziej wszechstronny, ponieważ pozwala nie tylko na utratę edycji funkcji, ale także na wprowadzanie i śledzenie zmian kodonów DNA , polimorfizmu pojedynczego nukleotydu , indeli i innych rodzajów zmian genetycznych. Poprawiając wydajność naprawy DNA, wykorzystując zsyntetyzowane macierzowo oligodonorowe przewodnik-donor do wysokowydajnej edycji opartej na plazmidzie i integrując genomowy kod kreskowy, aby zapobiec utracie kodu kreskowego plazmidu, MAGESTIC prowadzi do bardziej jednolitych pul ze zintegrowanymi z genomem stabilnymi pojedynczymi kopiami kodów kreskowych i umożliwia solidne fenotypowanie.

Rekrutacja dawców

Ponieważ na edycję wielu miejsc w pulach może mieć wpływ wiele czynników, w tym nieskuteczny CRISPR Guide RNA , błędy syntezy DNA , rywalizacja z łączeniem niehomologicznych końców i inne wyzwania, które pojawiają się podczas tworzenia bibliotek multipleksowych, ekrany MAGESTIC wymagały ulepszonej naprawy DNA. W tym miejscu pojawia się aspekt rekrutacji dawców MAGESTIC. MAGESTIC osiąga większą wydajność edycji poprzez lokalizowanie DNA dawcy w miejscu pęknięć DNA wprowadzonych przez cięcie CRISPR.

Maszyna CRISPR tnie pożądane miejsca w genomie, a następnie MAGESTIC kieruje DNA dawcy do miejsca tego cięcia, aby skierować komórki do wprowadzenia zaprojektowanych zmian w miejscach cięcia DNA. Ta technologia nazywa się rekrutacją dawcy i opiera się na białku fuzyjnym, które zawiera jedną domenę rekrutowaną do pęknięć DNA i inną domenę, która wiąże się z DNA dawcy. Pozwala to na produkcję wysokiej jakości precyzyjnych puli edycji w drożdżach, gdzie każda komórka zawiera pojedynczą edycję i kod kreskowy DNA. Aspekt technologii związany z rekrutacją dawców może również poprawić wydajność edycji w dodatkowych typach komórek, takich jak komórki ssaków. To może pewnego dnia okazać się korzystne dla terapie genowe lub inne edycje terapeutyczne.