MARCM
Analiza mozaiki za pomocą represyjnego markera komórkowego lub MARCM to genetyczna technika tworzenia indywidualnie znakowanych homozygotycznych komórek w skądinąd heterozygotycznej Drosophila melanogaster . Było to kluczowe narzędzie w badaniu rozwoju Drosophila . Ta technika opiera się na rekombinacji podczas mitozy , w której pośredniczy rekombinacja FLP-FRT . Jako jedna kopia genu, dostarczana przez chromosom balansujący , często wystarcza do uratowania zmutowanego fenotypu , klony MARCM można wykorzystać do badania zmutowanego fenotypu u zwierząt typu dzikiego .
Krzyże
.gif)
W celu znakowania małych populacji komórek pochodzących od wspólnego przodka MARCM wykorzystuje system GAL4-UAS . Gen markerowy, taki jak GFP, jest umieszczany pod kontrolą promotora UAS . GAL4 jest wszechobecny w tych muchach, co napędza ekspresję markera. Ponadto GAL80 jest napędzany przez silny promotor, taki jak tubP. Gal80 jest inhibitorem GAL4 i tłumi ekspresję GFP w normalnych warunkach. Ten element tubP-GAL80 jest umieszczany dystalnie w stosunku do miejsca FRT. Drugie miejsce FRT jest umieszczane w trans w stosunku do miejsca GAL80, zwykle z genem lub mutacją, która jest przedmiotem zainteresowania, dystalnie od niego. Wreszcie, rekombinaza FLP jest kierowana przez indukowalny promotor, taki jak szok termiczny.
Gdy indukowana jest transkrypcja FLP, dochodzi do rekombinacji chromosomów w dwóch miejscach FRT w komórkach przechodzących mitozę. Komórki te podzielą się na dwie homozygotyczne komórki potomne — jedną zawierającą oba elementy GAL80, a drugą nie zawierającą żadnego. Komórka potomna pozbawiona GAL80 zostanie wyznakowana dzięki ekspresji markera poprzez system GAL4-UAS. Wszystkie kolejne komórki potomne tego progenitorowego również będą eksprymować marker.
Laboratoria często mają linie gotowe do MARCM, które mają indukowalny FLP, GAL80 dystalnie do miejsca FRT, GAL4 i UAS-Marker. Można je łatwo krzyżować z muchami, które mają mutację będącą przedmiotem zainteresowania dystalnie od miejsca FRT.
Używa
Korzystając z MARCM, można łatwo prześledzić wszystkie komórki, które zostały wygenerowane z jednego progenitora. Jest to przydatne narzędzie do śledzenia rozwoju i określonych linii komórkowych w różnych warunkach środowiskowych. Zastosowania MARCM obejmują badanie obwodów neuronalnych , analizę klonów, ekrany genetyczne , spermatogenezę , rozwój stożka wzrostu , neurogenezę i przerzuty nowotworu .
Dzięki MARCM osiągnięto wiele postępów w zrozumieniu rozwoju Drosophila. Rozwój, linie rodowe i charakterystyka wtórnych dróg aksonów, anatomiczne mapy neuronów cholinergicznych w układach wzrokowych, linie rodowe dające początek rusztowaniu hemineuromeru klatki piersiowej i ramy rozwojowe architektury OUN, rola delty w programowaniu rozwojowym brzusznego rdzenia nerwowego , promujące budzenie komórki oktopaminergiczne w przyśrodkowym protocerebrum , geny zaangażowane w neuronalną morfogenezę ciał grzybów i regulację spoidła wskazówki dotyczące aksonów zostały zidentyfikowane za pomocą technik MARCM.
Wariacje
Istnieje wiele odmian MARCM. Twin-spot MARCM pozwala na znakowanie siostrzanych klonów dwoma oddzielnymi markerami, co pozwala na wyższą rozdzielczość śledzenia linii. W odwrotnym MARCM mutacja będąca przedmiotem zainteresowania jest umieszczana na tym samym chromosomie co GAL80, tak że homozygotyczne klony typu dzikiego będą znakowane. Flip-Out MARCM podkreśla pojedyncze komórki wewnątrz zmutowanych klonów (patrz „Drosophila Dscam jest wymagana do rozbieżnej segregacji siostrzanych gałęzi i tłumi ektopowe rozwidlenie aksonów”, Neuron, 2002). System Q pozwala na niezależny od GAL4 MARCM przy użyciu systemu QF/QS. Lethal MARCM pozwala na generowanie dużych, zaznaczonych populacji homozygotycznych poprzez włączenie letalnej mutacji w pobliżu miejsca GAL80. Kontrola podwójnej ekspresji MARCM wykorzystuje system transkrypcji LexA-VP16 zgodnie z GAL4-UAS. MARCM jest również często używany jako ekran genetyczny.