Mikromacierz peptydowa
| Inne nazwy | Czip peptydowy, macierz peptydowa |
|---|---|
| Używa | Badanie właściwości wiążących, specyficzności i funkcjonalności oraz kinetyki oddziaływań białko-peptyd lub białko-białko |
Mikromacierz peptydowa (powszechnie znana również jako mikromacierz peptydowa lub mikromacierz z epitopem peptydowym) to zbiór peptydów wyświetlany na stałej powierzchni, zwykle szklanej lub plastikowej. Czipy peptydowe są używane przez naukowców z dziedziny biologii, medycyny i farmakologii do badania właściwości i funkcjonalności wiązania oraz ogólnie kinetyki interakcji białko-białko . W badaniach podstawowych mikromacierze peptydowe są często wykorzystywane do profilowania enzymów (takich jak kinaza , fosfataza , proteaza , acetylotransferaza , deacetylaza histonowa itp.), aby zmapować epitop przeciwciała lub znaleźć kluczowe reszty do wiązania białka. Praktyczne zastosowania to odkrywanie seromarkerów , profilowanie zmieniających się humoralnych odpowiedzi immunologicznych poszczególnych pacjentów w trakcie progresji choroby, monitorowanie interwencji terapeutycznych, stratyfikacja pacjentów oraz opracowywanie narzędzi diagnostycznych i szczepionek .
Zasada
Zasada testu mikromacierzy peptydowych jest podobna do protokołu ELISA . Peptydy (do dziesiątek tysięcy w kilku kopiach) są połączone z powierzchnią szklanego chipa, zwykle wielkości i kształtu szkiełka mikroskopowego. Ten chip peptydowy można bezpośrednio inkubować z różnymi próbkami biologicznymi, takimi jak oczyszczone enzymy lub przeciwciała , surowice pacjentów lub zwierząt , lizaty komórkowe , a następnie wykrywać je w sposób zależny od znacznika, na przykład za pomocą pierwszorzędowego przeciwciała ukierunkowanego na związane białko lub zmodyfikowanych substratów. Po kilku etapach płukania nakłada się drugorzędowe przeciwciało o wymaganej specyficzności (np. ludzkie/mysie anty-IgG lub anty-fosfotyrozynowe lub anty-myc). Zwykle przeciwciało drugorzędowe jest znakowane znacznikiem fluorescencyjnym, który można wykryć za pomocą skanera fluorescencyjnego. Inne metody wykrywania zależne od znacznika obejmują chemiluminescencję, kolorymetrię lub autoradiografię.
Testy zależne od etykiety są szybkie i wygodne do wykonania, ale wiążą się z ryzykiem uzyskania wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych. Niedawno do pomiaru szerokiego zakresu aktywności enzymów zastosowano wykrywanie bez znaczników, w tym spektroskopię powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR), spektrometrię mas (MS) i wiele innych bioczujników optycznych.
Mikromacierze peptydowe wykazują kilka zalet w porównaniu z mikromacierzami białkowymi :
- Łatwość i koszt syntezy
- Wydłużona stabilność półki
- Detekcja zdarzeń wiązania na poziomie epitopu, umożliwiająca badanie m.in. rozprzestrzeniania się epitopu
- Elastyczny projekt sekwencji peptydów (tj. modyfikacje posttranslacyjne, różnorodność sekwencji, aminokwasy nienaturalne…) i chemii immobilizacji
- Wyższa powtarzalność między seriami
Produkcja mikromacierzy peptydowej
Mikromacierz peptydowa to płaskie szkiełko z peptydami naniesionymi na nie lub złożonymi bezpośrednio na powierzchni przez syntezę in situ. Podczas gdy nakrapiane peptydy mogą podlegać kontroli jakości, która obejmuje analizę spektrometrem mas i normalizację stężenia przed plamieniem i wynikają z pojedynczej partii syntetycznej, peptydy syntetyzowane bezpośrednio na powierzchni mogą podlegać zmianom między partiami i ograniczonym możliwościom kontroli jakości. Jednak synteza peptydów na chipie umożliwia równoległą syntezę dziesiątek tysięcy peptydów, zapewniając większe biblioteki peptydów w połączeniu z niższymi kosztami syntezy. Peptydy są idealnie połączone kowalencyjnie przez wiązanie chemoselektywne, co prowadzi do peptydów o tej samej orientacji do profilowania interakcji. Niektóre alternatywne procedury opisują niespecyficzne wiązanie kowalencyjne i immobilizację adhezyjną.
Jednak metody litograficzne mogą być stosowane w celu przezwyciężenia problemu nadmiernej liczby cykli sprzęgania. Opisano kombinatoryczną syntezę macierzy peptydowych na mikroczipie za pomocą drukowania laserowego, gdzie zmodyfikowana kolorowa drukarka laserowa jest używana w połączeniu z konwencjonalną syntezą peptydów w fazie stałej chemia. Aminokwasy są immobilizowane w cząsteczkach tonera, a peptydy są drukowane na powierzchni chipa w kolejnych, kombinatorycznych warstwach. Topienie tonera na początku reakcji sprzęgania zapewnia, że dostarczanie aminokwasów i reakcję sprzęgania można przeprowadzić niezależnie. Kolejną zaletą tej metody jest to, że każdy aminokwas można wytworzyć i oczyścić oddzielnie, a następnie osadzić go w cząsteczkach tonera, co pozwala na długotrwałe przechowywanie.
Zastosowania mikromacierzy peptydowych
Mikromacierze peptydowe można wykorzystać do badania różnych rodzajów interakcji białko-białko, szczególnie tych obejmujących modułowe podstruktury białkowe zwane modułami rozpoznawania peptydów lub, najczęściej, domeny interakcji białkowych. Powodem tego jest to, że takie podstruktury białkowe rozpoznają krótkie motywy liniowe, często eksponowane w natywnie nieustrukturyzowanych regionach partnera wiążącego, tak że oddziaływanie można modelować in vitro za pomocą peptydów jako sond i modułu rozpoznawania peptydów jako analitu. Większość publikacji można znaleźć w kontekście monitorowania odporności i profilowania enzymów.
Immunologia
- Mapowanie regionów immunodominujących w antygenach lub całych proteomach
- Odkrycie seromarkerów
- Monitorowanie badań klinicznych
- Profilowanie sygnatur przeciwciał i mapowanie epitopów
- Znalezienie przeciwciał neutralizujących
Profilowanie enzymów
- Identyfikacja substratów dla enzymów sierocych
- Optymalizacja znanych substratów enzymów
- Wyjaśnienie szlaków transdukcji sygnału
- Wykrywanie zanieczyszczających aktywności enzymów
- Ustalenie sekwencji konsensusu i kluczowych reszt
- Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko w obrębie kompleksu
Analiza i ocena wyników
Analiza danych i ocena wyników to najważniejsza część każdego eksperymentu z mikromacierzami. Po zeskanowaniu preparatów z mikromacierzy skaner rejestruje 20-bitowy, 16-bitowy lub 8-bitowy obraz numeryczny w formacie pliku ze znakowanym obrazem (*.tif). Obraz .tif umożliwia interpretację i ocenę ilościową każdej plamki fluorescencyjnej na zeskanowanym szkiełku mikromacierzy. Te dane ilościowe są podstawą do przeprowadzenia analizy statystycznej zmierzonych zdarzeń wiązania lub modyfikacji peptydów na szkiełku mikromacierzy. W celu oceny i interpretacji wykrytych sygnałów należy przeprowadzić alokację plamki peptydowej (widocznej na obrazie) i odpowiadającej jej sekwencji peptydowej. Dane do alokacji są zwykle zapisywane w pliku GenePix Array List (.gal) i dostarczane razem z mikromacierzą peptydową. Plik .gal (plik tekstowy oddzielony tabulatorami) można otworzyć za pomocą modułów oprogramowania do kwantyfikacji mikromacierzy lub przetworzyć za pomocą edytora tekstu (np. notatnika) lub programu Microsoft Excel. Ten plik „gal” jest najczęściej dostarczany przez producenta mikromacierzy i jest generowany przez wejściowe pliki txt i oprogramowanie śledzące wbudowane w roboty produkujące mikromacierze.