Mikroskopia pola świetlnego

Mikroskopia pola świetlnego ( LFM ) jest metodą obrazowania mikroskopowego trójwymiarowego (3D) bez skanowania, opartą na teorii pola świetlnego . Technika ta pozwala na obrazowanie dużych objętości w czasie poniżej sekundy (~10 Hz) ([~0,1 do 1 mm] ³ ) z rozdzielczością przestrzenną ~1 μm w warunkach słabego rozpraszania i półprzezroczystości, czego nigdy nie osiągnięto innymi metodami. Podobnie jak w przypadku tradycyjnego renderowania pola świetlnego , obrazowanie LFM składa się z dwóch etapów: przechwytywania i przetwarzania pola świetlnego. W większości konfiguracji mikrosoczewka array służy do przechwytywania pola światła. Jeśli chodzi o przetwarzanie, może ono opierać się na dwóch rodzajach reprezentacji propagacji światła: optyki promieniowej i obrazie optyki falowej . Laboratorium grafiki komputerowej Uniwersytetu Stanforda opublikowało swój pierwszy prototyp LFM w 2006 roku i od tego czasu pracuje nad najnowszymi rozwiązaniami.

Generowanie pola świetlnego

Parametryzacja promieni w mikroskopie pola świetlnego. (A) Parametryzacja pola świetlnego bez soczewki przekaźnikowej. Płaszczyzna obiektu sprzęga się z płaszczyzną układu mikrosoczewek poprzez obiektyw , a płaszczyzna obiektywu łączy się z płaszczyzną czujnika za pośrednictwem mikrosoczewek: pośredni obraz dwóch punktów znajduje się na płaszczyźnie układu mikrosoczewek, przy czym jedna mikrosoczewka odpowiada jednemu punktowi; każdy podobraz za odpowiednią mikrosoczewką zawiera obraz obiektywu. (B) Parametryzacja pola świetlnego za pomocą układu przekaźnikowego. Koniugacja między punktami na płaszczyźnie ogniskowej i mirolenses nadal pozostaje; jednak podobraz za każdą mikrosoczewką zawiera tylko część obiektywu. W obu systemach promień jest parametryzowany jako kombinacja współrzędnej 2D mikrosoczewki, przez którą przechodzi promień, oraz współrzędnej 2D piksela podobrazu, na który pada.

Pole świetlne to zbiór wszystkich promieni przepływających przez pewną wolną przestrzeń, gdzie każdy promień można sparametryzować za pomocą czterech zmiennych. W wielu $dwie współrzędne$ 2D jako - $na$ dwóch równoległych płaszczyznach, Zgłoszony do parametryzacji. W związku z tym intensywność pola świetlnego 4D można opisać jako funkcję skalarną: ${\ textstyle L_ {f} (s, t, u, v)}$$,$ gdzie jest między dwiema płaszczyznami.

LFM można zbudować w oparciu o tradycyjną konfigurację szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego i standardowej kamery CCD lub sCMOS . Pole świetlne jest generowane przez umieszczenie matrycy mikrosoczewek na pośredniej płaszczyźnie obrazu obiektywu ( lub tylnej płaszczyźnie ogniskowej opcjonalnej soczewki przekaźnikowej), a następnie jest rejestrowane przez umieszczenie czujnika kamery na tylnej płaszczyźnie ogniskowej mikrosoczewek. W rezultacie współrzędne mikrosoczewek ${\ Displaystyle (s, t)}$ skoniugować z tymi na płaszczyźnie przedmiotowej (jeśli zostaną dodane dodatkowe soczewki przekaźnikowe, to na przedniej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu) ${\ Displaystyle (s', t')}$ ; współrzędne pikseli za każdą mikrosoczewką $,$$\ Displaystyle (u', v'$ na płaszczyźnie obiektywu . $wygody$ będziemy nazywać płaszczyznę płaszczyzną ostrości Odpowiednio, jest $ogniskową$ mikrosoczewek (tj. odległością między płaszczyzną układu mikrosoczewek a płaszczyzną czujnika)

Ponadto apertury i ogniskowa każdej soczewki oraz wymiary czujnika i układu mikrosoczewek powinny być odpowiednio dobrane, aby zapewnić, że nie ma nakładania się ani pustych obszarów między sąsiednimi podobrazami za odpowiednimi mikrosoczewkami.

Realizacja ze zdjęcia ray optics

Ta sekcja przedstawia głównie prace Levoy i in ., 2006.

Widoki perspektywiczne pod różnymi kątami

Ze względu na sprzężone relacje, jak wspomniano powyżej, każdy ${$${i}, t_ {i})}$ s $($ odpowiada promieniowi przechodzącemu przez punkt ${\ Displaystyle (s_ {i} ', t_ {i}')}$ w kierunku ${\ Displaystyle (u_ {j} ', v_ {j} ')}$ . Dlatego $wyodrębniając$ piksel ${\ textstyle L_ {f} (:,:, u_ {j}, v_ {j})}$ uzyskuje się widok perspektywiczny pod . W tym scenariuszu rozdzielczość przestrzenna jest określana przez liczbę mikrosoczewek; rozdzielczość kątowa jest określana przez liczbę pikseli za każdą mikrosoczewką.

Widoki tomograficzne oparte na syntetycznym przeogniskowaniu

Krok 1: Cyfrowe ponowne ogniskowanie

Cyfrowe ponowne ogniskowanie pola świetlnego . Załóżmy, że oryginalny obraz został zogniskowany na płaszczyźnie, która łączy się z płaszczyzną układu mikrosoczewek, dlatego obraz powinien zostać zsyntetyzowany przez zsumowanie pikseli za każdą mikrosoczewką, aby utworzyć cyfrowe ogniskowanie na tej płaszczyźnie. Teraz chcemy ponownie skupić się na innej płaszczyźnie, której sprzężona płaszczyzna jest oddalona o α f od płaszczyzny czujnika, renderując promienie zdefiniowane między płaszczyzną układu mikrosoczewek a płaszczyzną czujnika. Aby uzyskać intensywność każdego punktu na płaszczyźnie ponownego ogniskowania, sumujemy promienie, których odwrotne pomocnicze linie kończą się w tym punkcie. Ta figura jest demonstracją syntetycznego ponownego ogniskowania w 1 wymiarze, a drugi wymiar może być niezależnie ponownie ogniskowany w ten sam matematyczny sposób. Ten rysunek jest modyfikacją ryc. 1 w Ren Ng 2005.

Ogniskowanie syntetyczne wykorzystuje przechwycone pole światła do obliczenia ogniskowania zdjęcia w dowolnej sekcji. Po prostym zsumowaniu wszystkich pikseli w każdym podobrazie za mikrosoczewką (co odpowiada zebraniu całego promieniowania pochodzącego z różnych kątów padającego na tę samą pozycję), obraz jest skupiany dokładnie na płaszczyźnie, która łączy się z płaszczyzną układu mikrosoczewek:

${\ Displaystyle E_ {f} (s, t) = {1 \ ponad f ^ {2}}\iint L_{f}(s,t,u,v)\cos ^{4}\phi ~dudv}$ ,

gdzie jest kątem między $promieniem$ a normalną płaszczyzny czujnika i $^{2}+v^{2}}}/f)}$${\ textstyle \ phi = \ arctan ({\ sqrt {$ jeśli początek układu współrzędnych każdego podobrazu znajduje się na głównej osi optycznej odpowiedniej mikrosoczewki. Teraz można zdefiniować nową funkcję pochłaniającą efektywny współczynnik projekcji ${\ Displaystyle \ cos ^ {4} \ phi}$$natężenia$ pola świetlnego i uzyskać rzeczywisty zbiór jasności każdego piksela: $_ {f} = L_{f}\cos^{4}\phi}$ .

Aby skupić się na innej płaszczyźnie poza przednią płaszczyzną ogniskową obiektywu, powiedzmy na płaszczyźnie, której płaszczyzna sprzężona jest oddalona od płaszczyzny czujnika, płaszczyzna sprzężona może ${\ Displaystyle f'=\ alpha f}$ zostać przeniesiony z ${$ i ponownie sparametryzować jego pole świetlne z powrotem do pierwotnego w: $fa$$displaystyle f}$ : fa {\

${\ Displaystyle {\ bar {L }}_{\alpha f}(s,t,u,v)={\bar {L}}_{f}(u+(su)/\alpha ,v+(tv)/\alpha ,u,v) }$ .

W ten sposób ponownie zogniskowane zdjęcie można obliczyć za pomocą następującego wzoru:

${\ Displaystyle E _ {\ alfa f} (s, t) = {1 \ ponad \ alfa ^ {2} f ^ {2}} \ iint {\ bar {L}} _ {f} (u (1-1 /\alpha )+s/\alpha ,v(1-1/\alpha )+t/\alpha ,u,v)~dudv}$ .

W rezultacie generowany jest stos ogniskowy, aby podsumować natychmiastowe obrazowanie 3D przestrzeni obiektu. Ponadto syntetycznie możliwe są również nachylone lub nawet zakrzywione płaszczyzny ogniskowania. Ponadto każdy zrekonstruowany obraz 2D skupiony na dowolnej głębokości odpowiada wycinkowi 2D pola świetlnego 4D w domenie Fouriera , gdzie złożoność algorytmu można zmniejszyć z ${\ displaystyle O (n ^ {4} )}$ do ${\ Displaystyle O (n ^ {2} \ log n)}$ .

Krok 2: Pomiar funkcji rozproszenia punktowego

$różni$$rozogniskowanie$ stos ognisk się od rzeczywistego rozkładu intensywności wokseli , co jest naprawdę Zamiast tego jest splotem i funkcją rozrzutu punktów (PSF): $FS}$$displaystyle$

${\ Displaystyle V * PSF = FS.}$

W związku z tym należy zmierzyć trójwymiarowy kształt PSF, aby odjąć jego efekt i uzyskać intensywność netto wokseli. Pomiar ten można łatwo wykonać, umieszczając kulkę fluorescencyjną w środku pierwotnej płaszczyzny ogniskowania i rejestrując jej pole świetlne, na podstawie którego ustala się trójwymiarowy kształt PSF poprzez syntetyczne ogniskowanie na różnej głębokości. Biorąc pod uwagę, że PSF jest uzyskiwany z tą samą konfiguracją LFM i procedurą cyfrowego ponownego ogniskowania, co stos ognisk, pomiar ten poprawnie odzwierciedla kątowy zakres promieni przechwyconych przez obiektyw (w tym wszelkie spadki intensywności); dlatego ten syntetyczny PSF jest w rzeczywistości wolny od szumów i aberracji. Kształt PSF można uznać za identyczny wszędzie w naszym pożądanym pole widzenia (FOV); w związku z tym można uniknąć wielu pomiarów.

Krok 3: Dekonwolucja 3D

W domenie Fouriera rzeczywista intensywność wokseli ma bardzo prosty związek ze stosem ogniskowym i PSF:

${\ Displaystyle {\ mathcal {F}} (V) = {\ Frac {{\ mathcal {F}} (FS)} {{\ mathcal { F}}(PSF)}}}$ ,

gdzie $jest$ operatorem Fouriera . Jednak bezpośrednie rozwiązanie powyższego równania może nie być możliwe, biorąc pod uwagę fakt, że apertura ma ograniczony rozmiar, co skutkuje ograniczeniem pasma PSF ( tj. jego transformata Fouriera ma zera). Zamiast tego algorytm iteracyjny zwany ograniczoną dekonwolucją iteracyjną w dziedzinie przestrzennej jest tutaj znacznie bardziej praktyczny:

1. ${\ Displaystyle \ bigtriangleup ^ {(k + 1)} ~ \ lefttarrow ~ FS-V ^ {(k)} * PSF}$ ;
2. ${\ Displaystyle V ^ {(k + 1)} ~ \ lefttarrow ~ \ max (V ^ {(k)} + \ dużytrójkąt w górę ^{(k+1)},0)}$ .

$PSF}$$spadku$ gradientu: oszacowanie $jest$ ulepszane iteracyjnie przez obliczenie różnicy między rzeczywistym stosem ogniskowym szacowanym stosem ogniskowych $\ textstyle$$jest$$.$ i korygowanie z bieżącą różnicą ( ograniczona do nieujemnej)

Fotografia plasterków Fouriera

Formułę można przepisać, $.$ Ponieważ operator fotografii ${\ Displaystyle {\ mathcal {P}} _ {\ alfa} [{\ bar {L_ {f}} }](s,t)=E_{\alpha f}(s,t)}$ można postrzegać jako ścinanie, po którym następuje projekcja, wynik powinien być proporcjonalny do rozszerzonego wycinka 2D 4D transformaty Fouriera pola światła. Dokładniej, ponownie zogniskowany obraz można wygenerować z widma Fouriera 4D pola świetlnego poprzez wyodrębnienie wycinka 2D, zastosowanie odwrotnej transformacji 2D i skalowanie. Przed dowodem najpierw wprowadzimy operatory:

1. Operator projekcji ${\ Displaystyle {\ mathcal {I}} _ {M} ^ {N} [f] (x_ {1}, ..., x_ {M}) = \ int {f (x_ {1}, ... ,x_{N})dx_{M+1}...dx_{N}}}$
2. ${\ Displaystyle {\ mathcal {S}$ krojenia:
3. Fotografia Zmiana podstawy : Niech $że$ operator zmiany podstawy funkcji 4-wymiarowej tak ${\ Displaystyle {\ mathcal {B}} [f] (\ operatorname {x}) = f ({\ mathcal {B}} ^ {- 1} \ operatorname {x})}$ z ${\ Displaystyle {\ mathcal {B}} _ {\ alfa} = {\ zacząć {bmatrix} \ alfa i 0 i 1-\ alfa i 0 \\ 0 i \ alfa i 0 i 1- \ alfa \\ 0 i 0 i 1 i 0 \\ 0 i 0 i 0 i 1 \ koniec { bmacierz}}}$ .
4. Operator transformaty Fouriera $.$ Niech N-wymiarowy operator transformaty Fouriera

Za pomocą tych definicji możemy przepisać ${\ Displaystyle {\ mathcal {P}} _ {\ alfa} [{\ bar {L_ {f}}}] (s,t)={1 \over \alpha ^{2}f^{2}}\iint {\bar {L}}_{f}(u(1-1/\alpha )+s/\alpha v(1-1/\alpha)+t/\alpha,u,v)~dudv\equiv {\frac {1}{\alpha ^{2}f^{2}}}{\mathcal {I} }_{2}^{4}\circ {\mathcal {B}}_{\alpha}[L_{f}]}$ .

Zgodnie z uogólnionym twierdzeniem Fouriera o wycinku mamy

${\ Displaystyle {\ mathcal {F}} ^ {M} \ circ {\ mathcal {I}} _ {M} ^ {N} \ circ {\ mathcal {B}} \ equiv {\ mathcal {S }}_{M}^{N}\circ {\frac {{\mathcal {B}}^{-T}}{|{\mathcal {B}}^{-T}|}}\circ {\ obliczenia matematyczne {F}}^{N}}$ ,

stąd operator fotografii ma postać

$\ Displaystyle {\ mathcal {P}} _ {\ alfa} [{\ bar {L_{f}}}](s,t)\equiv {\frac {1}{f^{2}}}{\mathcal {F}}^{-2}\circ {\mathcal {S}} _{2}^{4}\circ {\mathcal {B}}_{\alpha}^{-T}\circ {\mathcal {F}}^{4}}$ .

Zgodnie ze wzorem wiemy, że fotografia jest odwrotną transformatą Fouriera 2D rozszerzonego wycinka 2D w 4D transformaty Fouriera pola światła.

Dyskretna fotografia z plasterkami Fouriera

Jeśli wszystko, co mamy do dyspozycji, to próbki pola świetlnego, zamiast wspomnianego powyżej twierdzenia o plasterkach Fouriera dla sygnału ciągłego, przyjmujemy dyskretne twierdzenie Fouriera, które jest uogólnieniem dyskretnej transformaty Radona, aby obliczyć przeogniskowany obraz.

$pole$ świetlne $\ Displaystyle T_ {s}, T_ {t}, T_{u},T_{v}}$ okresowe z okresami i jest zdefiniowany na hipersześcianie ${\ Displaystyle H = [-T_ {s}/2, T_ {s}/2 ]\razy [-T_{t}/2,T_{t}/2]\razy [-T_{u}/2,T_{u}/2]\razy [-T_{v}/2,T_{ v}/2]}$ . Załóżmy również, że istnieje ${\ Displaystyle N_ {s} \ razy N_ {t} \ razy N_ {u} \ razy N_ {v}}$ znane próbki pola świetlnego ${\ Displaystyle ({\ kapelusz {s}} \ Delta s, {\ kapelusz {t}} \ Delta t, {\ kapelusz {u}} \ Delta u, {\ kapelusz {v}} \ Delta v )}$ , gdzie ${\ Displaystyle {\ kapelusz {s}}, {\ kapelusz {t}}, {\ kapelusz {u}}, {\ kapelusz {v}} \ w \ mathbb {Z}}$ i ${\ Displaystyle \ Delta s, \ Delta t, \ Delta u, \ Delta v = {\ Frac {T_ {s }}{N_{s}}},{\frac {T_{t}}{N_{t}}},{\frac {T_{u}}{N_{u}}},{\frac {T_{ v}}{N_{v}}}}$ odpowiednio. Następnie możemy zdefiniować za pomocą interpolacji trygonometrycznej z tymi przykładowymi punktami: ${\ displaystyle {\ bar {L}} _ {f} ^ {d}}$

${\ Displaystyle {\ bar {L}} _ {f} ^ {d} ({\ kapelusz {s}}, {\ kapelusz {t}}, {\ kapelusz {u}}, {\ kapelusz {v}} )=\sum _{\omega _{\kapelusz {s}}}\sum _{\omega _{\kapelusz {t}}}\sum _{\omega _{\kapelusz {u}}}\sum _ {\omega _{\kapelusz {v}}}{\mathcal {\bar {L}}}_{f}^{d}(\omega _{\kapelusz {s}},\omega _{\kapelusz { t}},\omega _{\kapelusz {u}},\omega _{\kapelusz {v}})e^{2\pi i({\kapelusz {s}}\omega _{\kapelusz {s} }+{\kapelusz {t}}\omega _{\kapelusz {t}}+{\kapelusz {u}}\omega _{\kapelusz {u}}+{\kapelusz {v}}\omega _{\ kapelusz {v}})}}$ ,

Gdzie

${\ Displaystyle {\ mathcal {\ bar {L}}} _ {f} ^ {d} (\ omega _ {\ kapelusz {s}}, \ omega _ {\ kapelusz {t}}, \ omega _ {\ kapelusz {u}},\omega _{\kapelusz {v}})=\sum _{\kapelusz {s}}\sum _{\kapelusz {t}}\sum _{\kapelusz {u}}\sum _{\kapelusz {v}}{\bar {L}}_{f}^{d}({\kapelusz {s}},{\kapelusz {t}},{\kapelusz {u}},{\ kapelusz {v}})e^{2\pi i({\kapelusz {s}}\omega _{\kapelusz {s}}+{\kapelusz {t}}\omega _{\kapelusz {t}}+ {\kapelusz {u}}\omega _{\kapelusz {u}}+{\kapelusz {v}}\omega _{\kapelusz {v}})}}$ .

Należy zauważyć, że stałe czynniki są odrzucane dla uproszczenia.

$\ Displaystyle [-T_ {u}/2, T_ {u}/2]}$ ponownie skupioną fotografię, zastępujemy całkę nieskończoną we wzorze na sumowanie $, którego$${$ to i ${\ Displaystyle [-T_ {v} / 2, T_ {v} / 2 ]}$ . To jest,

${\ Displaystyle {\ mathcal {P}} _ {\ alfa} ^ {d} [{\ bar {L_ {f} ^ {d}}}] ({\ kapelusz {s}}, {\ kapelusz {t} })={1 \over \alpha ^{2}f^{2}}\sum _{-N_{u}/2}^{N_{u}/2}\sum _{-N_{v}/ 2}^{N_{v}/2}{\bar {L}}_{f}^{d}({\kapelusz {u}}\Delta u(1-1/\alfa)+{\kapelusz { s}}\Delta s/\alfa ,{\kapelusz {v}}\Delta v(1-1/\alfa)+{\kapelusz {t}}\Delta t/\alfa,{\kapelusz {u}} \Delta u,{\kapelusz {v}}\Delta v)}$ .

Następnie, zgodnie z twierdzeniem o dyskretnym przekroju Fouriera, możemy przedstawić fotografię za pomocą wycinka Fouriera:

${\ Displaystyle {\ mathcal {P}} _ {\ alfa} ^ {d} [{\ bar {L_ {f} ^ {d}}}] ({\ kapelusz {s}}, {\ kapelusz {t} })=\suma _{-N_{u}/2}^{N_{u}/2}\suma _{-N_{v}/2}^{N_{v}/2}{e^{2 \pi i({\kapelusz {s}}\omega _{\kapelusz {s}}+{\kapelusz {t}}\omega _{\kapelusz {t}})}{\mathcal {\bar {L} }}_{f}^{d}}{(\alpha \omega _{\hat {s}},\alpha \omega _{\hat {t}},(1-\alpha )\omega _{\ kapelusz {s}},(1-\alfa)\omega _{\kapelusz {t}})}}$

Realizacja z obrazu optyki falowej

kamera plenooptyczna oparta na optyce promieniowej wykazała korzystne działanie w świecie makroskopowym, dyfrakcja ogranicza rekonstrukcję LFM, pozostając przy żargonie optyki promieniowej. Dlatego przejście na optykę falową może być znacznie wygodniejsze. (Ta sekcja przedstawia głównie prace Broxtona i in ., 2013.)

Dyskretyzacja przestrzeni

Zainteresowany FOV jest podzielony na $z których$$każdy$ etykietę . W ten sposób cały FOV można dyskretnie przedstawić za pomocą wektora $}$ wymiarze $\ razy 1}$ . Podobnie wektor reprezentuje płaszczyznę czujnika, w której każdy element za $\ Displaystyle$$N_ {p} \ razy 1}$${\ Displaystyle \ operatorname {f} _ {j}}$ oznacza jeden piksel czujnika. W warunkach niespójnej propagacji między różnymi wokselami transmisja pola świetlnego z przestrzeni obiektu do czujnika może być liniowo powiązana za pomocą macierzy pomiarowej, w ${\ Displaystyle N_ {p} \ razy N_ {v}}$ w którym zawarte są informacje PSF:

${\ Displaystyle \ mathbf {f} = \ operatorname {H} ~ \ mathbf {g}.}$

W scenariuszu z optyką promieni stos ognisk jest generowany poprzez syntetyczne ogniskowanie promieni, a następnie stosowana jest dekonwolucja z syntetyzowanym PSF, aby zmniejszyć rozmycie spowodowane falową naturą światła. Z drugiej strony, na obrazie optyki falowej macierz pomiarowa $-$ opisująca transmisję pola świetlnego - jest obliczana bezpośrednio na podstawie propagacji fal W przeciwieństwie do przejściowych mikroskopów optycznych, których kształt PSF jest niezmienny (np. Airy Pattern ) w odniesieniu do położenia emitera, emiter w każdym wokselu generuje unikalny wzór na czujniku LFM. Innymi słowy, każda kolumna w $odrębna$ . W kolejnych sekcjach zostanie szczegółowo omówione obliczenie całej macierzy pomiarowej.

Optyczna odpowiedź impulsowa

Optyczna odpowiedź impulsowa $mathbf {x } \ in \ mathbb {R ^ {2}}}$$pola$ elektrycznego w pozycji 2D na płaszczyźnie czujnika, gdy izotropowe punktowe źródło jednostkowej amplitudy jest umieszczone w pewnym położeniu 3D ${\ Displaystyle \ mathbf {p} \ in \ mathbb {R ^ {3}}}$ w FOVie. Istnieją trzy etapy propagacji pola elektrycznego: podróż od źródła punktowego do natywnej płaszczyzny obrazu (tj. płaszczyzny układu mikrosoczewkowego), przejście przez układ mikrosoczewkowy i propagacja na płaszczyznę czujnika.

Krok 1: Propagacja przekracza cel

$W$ fali na natywnej płaszczyźnie z ${\ textstyle \ mathbf {p} = (p_ {1}, p_ {2}, p_ {3})}$ można obliczyć za pomocą skalarnej teorii Debye'a:

${\ Displaystyle U_ {i} (\ mathbf {x} \ mathbf {p}) = {\ Frac {\ mathrm {M} }{f_{obj}^{2}\lambda ^{2}}}\exp {\biggl (}-{\frac {iu}{4\sin ^{2}(\alpha /2) }}{\biggr )}\int _{0}^{\alpha}d\theta ~P(\theta)\exp {\biggl (}-{\frac {iu\sin ^{2}(\theta / 2)}{2\sin ^{2}(\alpha /2)}}{\biggr )}J_{0}{\biggl (}{\frac {\sin \theta }{\sin \alpha }}\ nu {\biggr )}\sin \theta}$ ,

gdzie jest ogniskową obiektywu; ${\ displaystyle f_ {obj}} jest$$powiększenie$ . ${\ Displaystyle \ lambda}$ to długość fali. ${\ Displaystyle \ alfa = \ arcsin (\ operatorname {NA} / n)}$ jest półkątem apertury numerycznej ( ${\ Displaystyle n}$ jest współczynnikiem załamania światła próbka). $_$ _ $_$ _ skorygowane cele Abbe-sine). $Bessela$ funkcją pierwszego . ${\ displaystyle \ nu}$ i ${\ displaystyle u}$ to odpowiednio znormalizowane promieniowe i osiowe współrzędne optyczne:

${\ Displaystyle \ nu \ gruby około k {\ sqrt {(x_ {1} -p_ {1}) ^ {2} +(x_{2}-p_{2})^{2}}}\sin \alpha}$

${\ Displaystyle u \ grube około 4kp_ {3} \ sin ^ {2} (\ alfa / 2)}$ ,

gdzie ${\ Displaystyle k = 2 \ pi n/\ lambda}$ jest liczbą falową.

Krok 2: Ustawianie ostrości przez układ mikrosoczewek

Każda mikrosoczewka może być traktowana jako maska ​​​​fazowa:

${\ Displaystyle \ phi (\ mathbf {x}) = \ exp {\ biggl (} {\ Frac {-ik} {2f} }\|\Delta \mathbf {x} \|_{2}^{2}{\biggr )}}$ ,

gdzie ${\ textstyle f}$ jest ogniskową mikrosoczewek i ${\ Displaystyle \ Delta \ mathbf {x} = \ mathbf {x} - \ mathbf {x} _ {\ soczewka mu}}$$jest$ wektorem skierowanym od środka mikrosoczewki do punktu mikrosoczewce. Warto zauważyć, że $niezerowe$ , ${\ Displaystyle \ mathbf {x}}$ znajduje się w efektywnym obszarze transmisji mikrosoczewki.

W ten sposób funkcję transmisji całej macierzy mikrosoczewek można przedstawić jako zawiłą z funkcją grzebienia 2D: ${\ Displaystyle \ phi (\ mathbf {x})}$

${\ Displaystyle \ Phi (\ mathbf {x}) = \ phi (\ mathbf {x}) * \ operatorname {grzebień} (\ mathbf {x} /d)}$ ,

gdzie $jest podziałką$ powiedzmy wymiarem) mikrosoczewek.

Krok 3: Propagacja bliskiego pola do czujnika

Propagację czoła fali z odległością $fa {\ displaystyle f}$ natywnej płaszczyzny obrazu do płaszczyzny czujnika można obliczyć za pomocą całki dyfrakcyjnej Fresnela :

${\ Displaystyle E (\ mathbf {x}) | _ {z = f} = {\ Frac {e ^ {ikf}} {i \ lambda f}} \ iint E (\ mathbf {x} ') | _ { z=0}\exp {\biggl (}{\frac {ik}{2f}}\|\mathbf {x} -\mathbf {x} '\|_{2}^{2}{\biggr )} d\mathbf {x} '}$ ,

gdzie ${\ textstyle E (\ mathbf {x} ') | _ {z = 0} = U_ {i} (\ mathbf {x} ', \ mathbf {p} )\Phi (\mathbf {x} ')}$ to czoło fali przechodzące bezpośrednio przez natywną płaszczyznę obrazowania.

Dlatego całą optyczną odpowiedź impulsową można wyrazić za pomocą splotu:

${\ Displaystyle h (\ mathbf {x}, \ mathbf {p}) = {\ biggl (} U_ {i} (\ mathbf {x}, \ mathbf {p}) \ Phi (\ mathbf {x}) { \biggr )}*{\biggl (}{\frac {e^{ikf}}{i\lambda f}}e^{{\frac {ik}{2f}}\mathbf {\|} \mathbf {x } \|_{2}^{2}}{\biggr )}}$ .

Obliczanie macierzy pomiarowej

Po uzyskaniu optycznej odpowiedzi impulsowej dowolny element w macierzy pomiaru $h_$ obliczyć jako: ${ij}}$

${\ Displaystyle h_ {ij} = \ int _ {\ alfa _ {j}} \ int _ {\ beta _ {i}} w_ {i} (\ mathbf {p}) | h (\ mathbf {x} ,\mathbf {p} )|^{2}d\mathbf {p} d\mathbf {x} }$ ,

gdzie $}}$ \ displaystyle \ alpha $}$$j$ jest obszarem piksela jest objętością woksela ${\ displaystyle i$ Filtr wagi $, aby$ woksela niż na krawędziach Liniowa całka superpozycji opiera się na założeniu, że fluorofory znajdują się w każdej nieskończenie małej objętości ${\textstyle d\mathbf {p}}$ doświadczają niespójnego, stochastycznego procesu emisji, biorąc pod uwagę ich szybkie, przypadkowe fluktuacje.

Rozwiązanie problemu odwrotnego

Głośny charakter pomiarów

Ponownie, ze względu na ograniczoną szerokość pasma, szum wystrzelenia fotonu i ogromny wymiar macierzy, niemożliwe jest bezpośrednie rozwiązanie odwrotnego problemu, ponieważ: ${\ textstyle \ mathbf {g} = \ operatorname {H} ^{-1}\mathbf {f}}$ . Zamiast tego stochastyczny związek między dyskretnym polem świetlnym a FOV bardziej przypomina:

${\ Displaystyle {\ kapelusz {\ mathbf {f}}}} \ sim \ operatorname {Pois} (\ operatorname {H} ~ {\ mathbf {g} + \ mathbf {b} )}$ ,

gdzie $tła$ mierzoną przed obrazowaniem; ${\ Displaystyle \ operatorname {Pois} (\ cdot)}$ to szum Poissona. Dlatego $wektorem losowym z wartościami$ fotoelektronów e ^- .

Oszacowanie maksymalnego prawdopodobieństwa

W oparciu o ideę maksymalizacji prawdopodobieństwa zmierzonego pola światła ${\hat {\mathbf {f}}}}$$textstyle$ przy określonym FOV tle ${\textstyle \mathbf {b} }$ , schemat iteracji Richardsona-Lucy zapewnia tutaj skuteczny algorytm dekonwolucji 3D:

${\ Displaystyle \ mathbf {g} ^ {(k + 1)} = \ operatorname {diag} (\ operatorname {H} ^ {T} \ mathbf {1}) ^ {-1} \ operatorname {diag} (\ macierz {H} ^{T}\mathrm {diag} (\mathrm {H} \mathbf {g} ^{(k)}+\mathbf {b} )^{-1}\mathbf {f} )\mathbf {g} ^{(k)}}$ .

$macierzy$ operator poza przekątną na zero

Aplikacje

Mikroskopia pola świetlnego do funkcjonalnego obrazowania neuronów

Począwszy od początkowych prac na Uniwersytecie Stanforda dotyczących zastosowania mikroskopii pola świetlnego do obrazowania wapnia u larw danio pręgowanego ( Danio Rerio ), w wielu artykułach zastosowano mikroskopię pola świetlnego do funkcjonalnego obrazowania neuronów, w tym do pomiaru dynamicznej aktywności neuronów w całym mózgu C. elegans , obrazowanie całego mózgu u larw danio pręgowanego, obrazowanie czujników aktywności wapnia i napięcia w mózgu muszek owocowych ( Drosophila ) z częstotliwością do 200 Hz i szybkie obrazowanie objętości 1 mm x 1 mm x 0,75 mm w hipokampie myszy poruszających się w środowisku wirtualnym. Ten obszar zastosowań jest szybko rozwijającym się obszarem na przecięciu optyki obliczeniowej i neuronauki.

Zobacz też

• Lekkie pole
• Mikrosoczewka
• Tomografia
• Synteza apertury
• Woksel