Mikroskopia przyżyciowa
Mikroskopia intravitalna jest formą mikroskopii , która umożliwia obserwację procesów biologicznych żywych zwierząt ( in vivo ) w wysokiej rozdzielczości , która umożliwia rozróżnienie poszczególnych komórek tkanki .
U ssaków , w niektórych warunkach eksperymentalnych, chirurgiczna implantacja okienka obrazowania jest wykonywana przed mikroskopią przyżyciową. Pozwala to na powtarzane obserwacje przez kilka dni lub tygodni. Na przykład, jeśli naukowcy chcą zwizualizować komórki wątroby żywej myszy , wszczepią okienko do obrazowania w brzuch myszy . Myszy są najczęściej wybieranymi zwierzętami do mikroskopii przyżyciowej, ale w szczególnych przypadkach inne gryzonie , takie jak szczury, mogą być bardziej odpowiednie. Zwierzęta są zwykle znieczulane podczas operacji i sesji obrazowania. Mikroskopia intravitalna jest wykorzystywana w kilku obszarach badań, w tym w neurologii , immunologii , badaniach nad komórkami macierzystymi i innych. Technika ta jest szczególnie przydatna do oceny postępu choroby lub działania leku.
Podstawowy pomysł
Mikroskopia przyżyciowa polega na obrazowaniu komórek żywego zwierzęcia przez okienko obrazowania, które jest wszczepiane do tkanki zwierzęcej podczas specjalnej operacji. Główną zaletą mikroskopii przyżyciowej jest to, że umożliwia obrazowanie żywych komórek, gdy znajdują się one w prawdziwym środowisku złożonego organizmu wielokomórkowego . W ten sposób mikroskopia przyżyciowa pozwala naukowcom badać zachowanie komórek w ich naturalnym środowisku lub in vivo, a nie w hodowli komórkowej
. Kolejną zaletą mikroskopii przyżyciowej jest to, że eksperyment można skonfigurować w taki sposób, aby umożliwić obserwację zmian zachodzących w żywej tkance organizmu w czasie. Jest to przydatne w wielu obszarach badań, w tym w immunologii i badaniach nad komórkami macierzystymi. Wysoka jakość nowoczesnych mikroskopów i oprogramowania do obrazowania umożliwia również obrazowanie subkomórkowe żywych zwierząt, co z kolei umożliwia badanie biologii komórki na poziomie molekularnym in vivo . Postępy w białku fluorescencyjnym Ważną rolę w rozwoju mikroskopii przyżyciowej odegrały również technologia i narzędzia genetyczne umożliwiające kontrolowaną ekspresję danego genu w określonym czasie w danej tkance.
Możliwość wygenerowania odpowiednich myszy transgenicznych ma kluczowe znaczenie dla badań mikroskopii przyżyciowej. Na przykład, aby zbadać zachowanie komórek mikrogleju w chorobie Alzheimera, badacze będą musieli skrzyżować transgeniczną mysz, która jest mysim modelem choroby Alzheimera, z inną transgeniczną myszą, która jest mysim modelem do wizualizacji komórek mikrogleju. Komórki muszą wytwarzać białko fluorescencyjne, aby można je było uwidocznić, a można to osiągnąć przez wprowadzenie transgenu .
Obrazowanie
Mikroskopię przyżyciową można przeprowadzić przy użyciu kilku technik mikroskopii świetlnej, w tym mikroskopii fluorescencyjnej szerokopolowej, konfokalnej , wielofotonowej , mikroskopii z wirującym dyskiem i innych. Głównym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę przy wyborze konkretnej techniki, jest głębokość penetracji potrzebna do zobrazowania obszaru oraz wymagana ilość szczegółów interakcji komórka-komórka .
Jeśli badany obszar znajduje się więcej niż 50–100 µm pod powierzchnią lub istnieje potrzeba uchwycenia interakcji między komórkami w małej skali, wymagana jest mikroskopia wielofotonowa. Mikroskopia wielofotonowa zapewnia znacznie większą głębokość penetracji niż jednofotonowa mikroskopia konfokalna. Mikroskopia wielofotonowa umożliwia również wizualizację komórek znajdujących się pod tkanką kostną, takich jak komórki szpiku kostnego . Maksymalna głębokość obrazowania za pomocą mikroskopii wielofotonowej zależy od właściwości optycznych tkanki i sprzętu doświadczalnego. Im bardziej jednorodna tkanka, tym lepiej nadaje się do mikroskopii przyżyciowej. Więcej unaczynione są na ogół trudniejsze do zobrazowania, ponieważ krwinki czerwone powodują pochłanianie i rozpraszanie wiązki światła mikroskopu.
Znakowanie fluorescencyjne różnych linii komórkowych różnymi kolorami białek umożliwia wizualizację dynamiki komórkowej w kontekście ich mikrośrodowiska . Jeśli rozdzielczość obrazu jest wystarczająco wysoka (50 – 100 μm), możliwe jest użycie kilku obrazów do wygenerowania trójwymiarowych modeli interakcji komórkowych, w tym wypukłości, które komórki tworzą, rozciągając się ku sobie. Modele 3D z poklatkowych umożliwiają ocenę szybkości i kierunkowości ruchów komórkowych. Struktury naczyniowe można również rekonstruować w przestrzeni 3D i zmieniać ich przepuszczalność
można monitorować przez pewien czas, ponieważ intensywność sygnału fluorescencyjnego barwników zmienia się, gdy zmienia się przepuszczalność naczyń. Mikroskopię przyżyciową o wysokiej rozdzielczości można wykorzystać do wizualizacji zdarzeń spontanicznych i przejściowych. Przydatne może być połączenie mikroskopii wielofotonowej i konfokalnej, ponieważ pozwala to uzyskać więcej informacji z każdej sesji obrazowania. Obejmuje to wizualizację większej liczby różnych typów komórek i struktur w celu uzyskania bardziej pouczających obrazów oraz wykorzystanie pojedynczego zwierzęcia do uzyskania obrazów wszystkich różnych typów komórek i struktur, które są interesujące w danym eksperymencie. To ostatnie jest przykładem zasady 3R realizacja zasady.
Obrazowanie struktur subkomórkowych
W przeszłości mikroskopię przyżyciową można było wykorzystywać jedynie do obrazowania procesów biologicznych na poziomie tkanki lub pojedynczej komórki. Jednak dzięki rozwojowi technik znakowania subkomórkowego i postępowi w minimalizowaniu artefaktów ruchowych (błędów generowanych przez bicie serca, oddech i ruchy perystaltyczne zwierzęcia podczas sesji obrazowania) obecnie możliwe staje się obrazowanie dynamiki organelli wewnątrzkomórkowych w niektórych tkankach.
Ograniczenia mikroskopii przyżyciowej
Jedną z głównych zalet mikroskopii przyżyciowej jest możliwość obserwowania interakcji komórek z ich mikrośrodowiskiem . Jednak wizualizacja wszystkich typów komórek w mikrośrodowisku jest ograniczona liczbą dostępnych rozróżnialnych znaczników fluorescencyjnych . Powszechnie przyjmuje się również, że niektóre tkanki, takie jak mózg, można wizualizować łatwiej niż inne, takie jak mięśnie szkieletowe . Różnice te wynikają ze zmienności jednorodności i przezroczystości różnych tkanek. Ponadto generowanie myszy transgenicznych z fenotypem interesujących i fluorescencyjnych białek w odpowiednich typach komórek jest często trudne i czasochłonne. Innym problemem związanym z zastosowaniem myszy transgenicznych jest to, że czasami trudno jest zinterpretować zmiany obserwowane między typu dzikiego a myszą transgeniczną, która reprezentuje fenotyp będący przedmiotem zainteresowania. Powodem tego jest to, że geny o podobnej funkcji mogą często kompensować zmieniony gen, który prowadzi do pewnego stopnia adaptacji.
Linki zewnętrzne
-
Media związane z mikroskopią Intravital w Wikimedia Commons
