Natywna ligacja chemiczna

Natywna ligacja chemiczna (NCL) jest ważnym rozszerzeniem koncepcji ligacji chemicznej do konstruowania większego łańcucha polipeptydowego przez kowalencyjną kondensację dwóch lub więcej niezabezpieczonych segmentów peptydów. Natywna ligacja chemiczna jest najskuteczniejszą metodą syntezy natywnych lub zmodyfikowanych białek o typowej wielkości ( tj . białek <~300 AA).

Reakcja

W natywnej ligacji chemicznej zjonizowana grupa tiolowa N-końcowej reszty cysteiny niezabezpieczonego peptydu atakuje C-końcowy tioester drugiego niezabezpieczonego peptydu, w wodnym buforze o pH 7,0 i temperaturze pokojowej. Ten etap transtioestryfikacji jest odwracalny w obecności katalizatora arylotiolowego, co sprawia, że ​​reakcja jest zarówno chemoselektywna, jak i regioselektywna, i prowadzi do powstania związku pośredniego z wiązaniami tioestrowymi. Związek pośredni szybko i spontanicznie przestawia się przez wewnątrzcząsteczkowe przesunięcie S,N-acylowe co skutkuje utworzeniem natywnego wiązania amidowego („ peptydowego ”) w miejscu ligacji (schemat 1).

Schemat 1: Dwuetapowy mechanizm natywnej ligacji chemicznej.

Uwagi :

  • Dodatki tiolowe:

Początkowy etap transtioestryfikacji natywnej chemicznej reakcji ligacji jest katalizowany przez dodatki tiolowe. Najbardziej skutecznym i powszechnie stosowanym katalizatorem tiolowym jest kwas 4-merkaptofenylooctowy (MPAA), (ref.).

Kluczową cechą natywnej chemicznej ligacji niezabezpieczonych peptydów jest odwracalność pierwszego etapu , reakcji wymiany tiol(ate)-tioester. Natywna ligacja chemiczna jest wyjątkowo regioselektywna, ponieważ etap wymiany tiol(at)-tioester jest swobodnie odwracalny w obecności dodanego katalizatora arylotiolowego. Wysokie wydajności otrzymanego końcowego produktu ligacji, nawet w obecności wewnętrznych reszt Cys w ​​jednym/obu segmentach, są wynikiem nieodwracalności drugiego (przesunięcie acylowe S-do-N) etapu tworzenia amidu w zastosowanych warunkach reakcji .

Żadne produkty uboczne nie powstają w reakcji z innymi grupami funkcyjnymi obecnymi w którymkolwiek segmencie peptydowym (np. Asp, kwasy karboksylowe łańcucha bocznego Glu; grupa aminowa Lys epsilon; hydroksyl fenolowy Tyr; hydroksyl Ser, Thr, itp.).

Kontekst historyczny

W 1992 roku Stephen Kent i Martina Schnölzer z The Scripps Research Institute opracował koncepcję „ligacji chemicznej”, pierwszej praktycznej metody kowalencyjnej kondensacji niezabezpieczonych segmentów peptydowych; kluczową cechą ligacji chemicznej jest tworzenie nienaturalnego wiązania w miejscu ligacji. Zaledwie dwa lata później, w 1994 roku, Philip Dawson, Tom Muir i Stephen Kent opisali „Native Chemical Ligation”, rozszerzenie koncepcji ligacji chemicznej na tworzenie natywnego wiązania amidowego („peptydowego”) po początkowej kondensacji nukleofilowej, która utworzyła tioester- związany produkt kondensacji zaprojektowany do spontanicznej zmiany układu do natywnego wiązania amidowego w miejscu ligacji.

Theodor Wieland i współpracownicy donieśli o przesunięciu acylu S-do-N już w 1953 r., kiedy reakcja tioestru waliny i cysteiny wykazano, że aminokwas w buforze wodnym daje dipeptyd walinę-cysteinę. Reakcja przebiegała za pośrednictwem tioestru zawierającego siarkę reszty cysteiny. Jednak praca Wielanda NIE doprowadziła do rozwoju natywnej chemicznej reakcji ligacji. Raczej badanie reakcji tioestru aminokwasu doprowadziło Wielanda i innych do opracowania metody „aktywnego estru” do syntezy chronionych segmentów peptydowych konwencjonalnymi metodami chemicznymi przeprowadzanymi w rozpuszczalnikach organicznych.

Cechy

Natywna ligacja chemiczna stanowi podstawę nowoczesnej chemicznej syntezy białek i została wykorzystana do przygotowania wielu białek i enzymów w drodze całkowitej syntezy chemicznej. Korzyścią z natywnej metody ligacji chemicznej jest to, że sprzęganie długich peptydów za pomocą tej techniki jest zazwyczaj prawie ilościowe i zapewnia syntetyczny dostęp do dużych peptydów i białek, których w inny sposób nie można uzyskać, ze względu na ich duży rozmiar, dekorację przez modyfikację potranslacyjną i zawierające nie -kodowany aminokwas lub inne chemiczne bloki budulcowe.

Natywna ligacja chemiczna jest z natury „zielona” w swojej ekonomii atomowej i zastosowaniu łagodnych rozpuszczalników. Obejmuje reakcję niezabezpieczonego tioestru peptydowego z drugim niezabezpieczonym peptydem, który ma N-końcową resztę cysteiny. Prowadzi się ją w roztworze wodnym o pH obojętnym, zwykle w 6 M chlorowodorku guanidyny, w obecności katalizatora arylotiolowego i zwykle daje ona prawie ilościowe wydajności pożądanego produktu ligacji.

Peptydowe tioestry można wytworzyć bezpośrednio za pomocą chemii Boc SPPS ; jednakże peptydy zawierające tioestry nie są trwałe na traktowanie zasadą nukleofilową, co uniemożliwia bezpośrednią syntezę tioestrów peptydowych za pomocą chemii Fmoc SPPS . Techniki syntezy peptydów na fazie stałej w chemii Fmoc do wytwarzania tioestrów peptydowych opierają się na syntezie hydrazydów peptydowych, które są przekształcane w tioestry peptydowe postsyntetycznie.

C-końcowe tioestry polipeptydowe można również wytwarzać in situ , stosując tak zwane układy przesunięć N,S -acylowych. Do tej rodziny należy grupa bis (2-sulfanyloetylo)amido, zwana także grupą SEA. C-końcowe bis (2-sulfanyloetylo) amidy polipeptydu (segmenty peptydowe SEA) reagują z peptydem Cys, dając natywne wiązanie peptydowe, jak w NCL. Ta reakcja, zwana ligacją natywnego peptydu SEA , jest użytecznym wariantem natywnej ligacji chemicznej.

Przy wytwarzaniu segmentów peptydowych, które zawierają N-końcową resztę cysteiny, należy unikać narażenia na ketony, ponieważ mogą one zakrywać N-końcową cysteinę. Nie stosować grup zabezpieczających uwalniających aldehydy lub ketony . Z tego samego powodu należy unikać stosowania acetonu , zwłaszcza do mycia naczyń szklanych przeznaczonych do liofilizacji .

Cechą natywnej techniki ligacji chemicznej jest to, że łańcuch polipeptydowy produktu zawiera cysteinę w miejscu ligacji. Cysteinę w miejscu ligacji można odsiarczyć do alaniny , rozszerzając w ten sposób zakres możliwych miejsc ligacji o reszty alaniny. Inne aminokwasy zawierające beta-tiol można stosować do natywnej ligacji chemicznej, po której następuje odsiarczanie. Alternatywnie można zastosować środki pomocnicze do ligacji zawierające tiol, które naśladują N-końcową cysteinę do reakcji ligacji, ale które można usunąć po syntezie. Zastosowanie środków pomocniczych zawierających tiol może nie być tak skuteczne jak ligacja na reszcie Cys. Natywną ligację chemiczną można również przeprowadzić z N-końcową resztą selenocysteiny.

C-końcowe tioestry polipeptydu wytwarzane technikami rekombinacji DNA można poddać reakcji z polipeptydem zawierającym N-końcową Cys za pomocą tej samej natywnej chemii ligacji, z wytworzeniem bardzo dużych półsyntetycznych białek. Natywna ligacja chemiczna tego rodzaju przy użyciu segmentu rekombinowanego polipeptydu jest znana jako ekspresjonowana ligacja białek. Podobnie, rekombinowane białko zawierające N-końcową Cys można poddać reakcji z syntetycznym tioestrem polipeptydowym . Zatem natywną ligację chemiczną można zastosować do wprowadzenia chemicznie zsyntetyzowanych segmentów do rekombinowanych białek, niezależnie od wielkości.

Zobacz też

  1. Bibliografia   _ Muir, TW; Clark-Lewis, I.; Kent, SB (1994). „Synteza białek przez natywną ligację chemiczną”. nauka . 266 (5186): 776–778. Bibcode : 1994Sci...266..776D . doi : 10.1126/science.7973629 . PMID 7973629 .
  2. ^    Agouridas V, El Mahdi O, Diemer V, Cargoët M, Monbaliu JM, Melnyk O (czerwiec 2019). „Natywna ligacja chemiczna i metody rozszerzone: mechanizmy, kataliza, zakres i ograniczenia”. Recenzje chemiczne . 119 (12): 7328–7443. doi : 10.1021/acs.chemrev.8b00712 . PMID 31050890 . S2CID 145023266 .
  3. Bibliografia _ Bokelmann, E.; Bauer L.; Lang, HU; Lau, H. (1953). "Über Peptidsynthesen. 8. Mitteilung Bildung von S-haltigen Peptiden durch intramolekulare Wanderung von Aminoacylresten". Anna Liebigs. chemia . 583 : 129–149. doi : 10.1002/jlac.19535830110 .
  4. ^   Ollivier, N. Dheur, J. Mhidia, R. Blanpain, A. Melnyk, O. (2010). „Bis (2-sulfanyloetylo) aminowa ligacja natywnego peptydu”. Listy organiczne . 12 (22): 5238–41. doi : 10.1021/ol102273u . PMID 20964289 . {{ cite journal }} : CS1 maint: wiele nazwisk: lista autorów ( link )
  5. Bibliografia    _ Raines, RT (2011). „Chemoselektywność w biologii chemicznej: reakcje przeniesienia acylu z siarką i selenem” . wg. chemia Rez . 44 (9): 752–761. doi : 10.1021/ar200081s . PMC 3242736 . PMID 21639109 .

Dalsza lektura

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Native_chemical_ligation&oldid=1143054000 ”