Obrazowanie metodą spektrometrii mas
Obrazowanie metodą spektrometrii mas ( MSI ) to technika stosowana w spektrometrii mas do wizualizacji przestrzennego rozkładu cząsteczek, takich jak biomarkery , metabolity , peptydy lub białka przez ich masy cząsteczkowe. Po zebraniu widma masowego w jednym miejscu próbka jest przesuwana do innego regionu i tak dalej, aż do zeskanowania całej próbki. Wybierając pik w wynikowym widmie, który odpowiada badanemu związkowi, dane MS są wykorzystywane do mapowania jego rozkładu w próbce. Daje to obrazy przestrzennie rozdzielonego rozkładu złożonego piksel po pikselu. Każdy zestaw danych zawiera prawdziwą galerię zdjęć, ponieważ każdy pik w każdym widmie można odwzorować przestrzennie. Pomimo faktu, że MSI jest ogólnie uważana za metodę jakościową, sygnał generowany przez tę technikę jest proporcjonalny do względnej obfitości analitu. Dlatego kwantyfikacja jest możliwa, gdy zostaną przezwyciężone jej wyzwania. Chociaż szeroko stosowane są tradycyjne metodologie, takie jak radiochemia i immunohistochemia osiągają ten sam cel co MSI, mają ograniczone możliwości analizy wielu próbek jednocześnie i mogą okazać się niewystarczające, jeśli badacze nie mają wcześniejszej wiedzy na temat badanych próbek. Najpopularniejsze technologie jonizacji w dziedzinie MSI to obrazowanie DESI , obrazowanie MALDI i obrazowanie spektrometrią masową jonów wtórnych ( obrazowanie SIMS ).
Historia
Ponad 50 lat temu MSI zostało wprowadzone za pomocą spektrometrii masowej jonów wtórnych (SIMS) do badania powierzchni półprzewodników przez Castainga i Slodziana. Jednak była to pionierska praca Richarda Caprioli i współpracowników pod koniec lat 90., pokazująca, w jaki sposób desorpcja / jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) można zastosować do wizualizacji dużych biomolekuł (takich jak białka i lipidy) w komórkach i tkankach, aby ujawnić funkcję tych cząsteczek i sposób, w jaki funkcja jest zmieniana przez choroby, takie jak rak, co doprowadziło do powszechnego stosowania MSI. Obecnie stosuje się różne techniki jonizacji, w tym SIMS, MALDI i desorpcyjną jonizację przez elektrorozpylanie (DESI) , a także inne technologie. Mimo to MALDI jest obecnie dominującą technologią w odniesieniu do klinicznych i biologicznych zastosowań MSI.
Zasada działania
MSI opiera się na rozkładzie przestrzennym próbki. Dlatego zasada działania zależy od techniki, która jest używana do uzyskiwania informacji przestrzennej. Dwie techniki stosowane w MSI to: mikrosonda i mikroskop.
Mikrosonda
Ta technika jest wykonywana przy użyciu zogniskowanej wiązki jonizacji do analizy określonego obszaru próbki poprzez wygenerowanie widma masowego. Widmo masowe jest zapisywane wraz z koordynacją przestrzenną miejsca pomiaru. Następnie wybiera się i analizuje nowy region, przesuwając próbkę lub wiązkę jonizacji. Te kroki są powtarzane, aż cała próbka zostanie zeskanowana. Łącząc wszystkie indywidualne widma masowe, można wykreślić mapę rozkładu intensywności w funkcji lokalizacji x i y. W rezultacie uzyskuje się zrekonstruowane obrazy molekularne próbki.
Mikroskop
W tej technice dwuwymiarowy detektor pozycyjny służy do pomiaru przestrzennego pochodzenia jonów generowanych na powierzchni próbki przez optykę jonową instrumentów. Rozdzielczość informacji przestrzennej będzie zależała od powiększenia mikroskopu, jakości optyki jonów i czułości detektora. Nowy region wciąż wymaga przeskanowania, ale liczba pozycji drastycznie spada. Ograniczeniem tego trybu jest skończona głębia widzenia występująca we wszystkich mikroskopach.
Zależność od źródła jonów
Techniki jonizacji dostępne dla MSI są dostosowane do różnych zastosowań. Jednym z kryteriów wyboru metody jonizacji jest wymóg przygotowania próbki oraz parametry pomiaru, takie jak rozdzielczość, zakres mas i czułość. Na tej podstawie najczęściej stosowaną metodą jonizacji są opisane poniżej MALDI , SIMS I DESI . Jednak inne pomniejsze techniki to ablacja laserowa, jonizacja przez elektrorozpylanie (LAESI) , laser-ablacja-indukcyjnie sprzężona plazma (LA-ICP) i nanorozpylanie desorpcja elektrorozpylanie jonizacja (nano-DESI) .
Obrazowanie SIMS
Spektrometria mas jonów wtórnych (SIMS) służy do analizy powierzchni ciał stałych i cienkich warstw poprzez napylanie powierzchni zogniskowaną wiązką jonów pierwotnych oraz zbieranie i analizę wyrzucanych jonów wtórnych. Istnieje wiele różnych źródeł pierwotnej wiązki jonów. Jednak pierwotna wiązka jonów musi zawierać jony, które znajdują się na wyższym końcu skali energii. Niektóre typowe źródła to: Cs + , O 2 + , O, Ar + i Ga + . Obrazowanie SIMS przeprowadza się w sposób podobny do mikroskopii elektronowej ; pierwotna wiązka jonów jest emitowana przez próbkę, podczas gdy rejestrowane są wtórne widma masowe. SIMS okazuje się korzystny w zapewnianiu najwyższej rozdzielczości obrazu, ale tylko na małej powierzchni próbek. Co więcej, ta technika jest powszechnie uważana za jedną z najbardziej czułych form spektrometrii mas, ponieważ może wykrywać pierwiastki w stężeniach tak małych jak 10 12 -10 16 atomów na centymetr sześcienny.
Multipleksowane obrazowanie wiązką jonów (MIBI) to metoda SIMS, która wykorzystuje przeciwciała znakowane izotopami metali do znakowania związków w próbkach biologicznych.
Zmiany w SIMS: W SIMS dokonano pewnych modyfikacji chemicznych w celu zwiększenia wydajności procesu. Obecnie stosowane są dwie oddzielne techniki, które pomagają zwiększyć ogólną wydajność poprzez zwiększenie czułości pomiarów SIMS: SIMS z ulepszoną matrycą (ME-SIMS) — ma takie samo przygotowanie próbki jak MALDI, ponieważ symuluje właściwości jonizacji chemicznej MALDI . ME-SIMS nie próbkuje prawie tak dużej ilości materiału. Jeśli jednak badany analit ma niską wartość masy, może wytworzyć widmo podobne do widma MALDI. ME-SIMS był tak skuteczny, że był w stanie wykrywać chemikalia o małej masie na poziomie subkomórkowym, co nie było możliwe przed opracowaniem techniki ME-SIMS. Druga stosowana technika nazywa się metalizacją próbki (Meta-SIMS) - jest to proces dodawania złota lub srebra do próbki. Tworzy to wokół próbki warstwę złota lub srebra, która zwykle ma grubość nie większą niż 1-3 nm. Zastosowanie tej techniki zaowocowało zwiększeniem czułości dla próbek o większej masie. Dodanie warstwy metalicznej pozwala również na konwersję próbek izolacyjnych na próbki przewodzące, dzięki czemu kompensacja ładunku w eksperymentach SIMS nie jest już wymagana.
Obrazowanie MALDI
Jonizacja desorpcji laserowej wspomaganej matrycą może być stosowana jako technika obrazowania spektrometrii mas dla stosunkowo dużych cząsteczek. Ostatnio wykazano, że najskuteczniejszym typem matrycy do stosowania jest matryca jonowa do obrazowania tkanki metodą MALDI. W tej wersji techniki próbka, zwykle cienki tkanki , jest przesuwana w dwóch wymiarach podczas widma masowego jest nagrany. Chociaż MALDI ma tę zaletę, że jest w stanie rejestrować rozkład przestrzenny większych cząsteczek, odbywa się to kosztem niższej rozdzielczości niż technika SIMS. Granica rozdzielczości bocznej dla większości nowoczesnych instrumentów wykorzystujących MALDI wynosi . Eksperymenty MALDI zwykle wykorzystują do jonizacji laser Nd:YAG (355 nm) lub N2 ( 337 nm).
Farmakodynamikę i toksykodynamikę w tkankach badano za pomocą obrazowania MALDI.
obrazowanie DESI
Desorpcja elektrorozpylanie Jonizacja jest techniką mniej destrukcyjną, która łączy w sobie prostotę i szybką analizę próbki. Próbka jest spryskiwana elektrycznie naładowaną mgłą rozpuszczalnika pod kątem, który powoduje jonizację i desorpcję różnych cząsteczek. Następnie generowane są dwuwymiarowe mapy obfitości wybranych jonów na powierzchni próbki w zależności od rozkładu przestrzennego. Technika ta ma zastosowanie do próbek stałych, ciekłych, zamrożonych i gazowych. Ponadto DESI umożliwia analizę szerokiej gamy związków organicznych i biologicznych, takich jak tkanki zwierzęce i roślinne oraz próbki kultur komórkowych, bez skomplikowanego przygotowania próbek. skan, jako skanowanie całej sekcji ciała. Fn
Porównanie technik jonizacji
| Źródło jonizacji | Rodzaj jonizacji | Anality | Rozkład przestrzenny | Zakres masy | |
|---|---|---|---|---|---|
| SIMS | Pistolet jonowy | Twardy | Jony elementarne, małe cząsteczki, lipidy | <10 m | 0-1000Da |
| MALDI | Wiązka lasera UV | Miękki | Lipidy, peptydy, białka | 20 m | 0-100 000 da |
| DESI | Rozpuszczalnik w sprayu | Miękki | Małe cząsteczki, lipidy, peptydy | 50 m | 0-2000 Da |
Połączenie różnych technik MSI i innych technik obrazowania
Łączenie różnych technik MSI może być korzystne, ponieważ każda poszczególna technika ma swoje zalety. Na przykład, gdy w tym samym skrawku tkanki potrzebne są informacje dotyczące zarówno białek, jak i lipidów, wykonanie DESI w celu analizy lipidów, a następnie MALDI w celu uzyskania informacji o peptydzie i sfinalizowanie stosowania barwnika (hematoksyliny i eozyny) w celu diagnostyki medycznej cechy strukturalne tkanki. Po drugiej stronie MSI z innymi technikami obrazowania, barwienie fluorescencyjne z MSI i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) z MRI można wyróżnić. Barwienie fluorescencyjne może dostarczyć informacji o wyglądzie niektórych białek obecnych w dowolnym procesie wewnątrz tkanki, podczas gdy MSI może dostarczyć informacji o zmianach molekularnych prezentowanych w tym procesie. Łącząc obie techniki, można wygenerować obraz multimodalny, a nawet obrazy 3D rozkładu różnych cząsteczek. W przeciwieństwie do tego MRI z MSI łączy ciągłą reprezentację 3D obrazu MRI ze szczegółową reprezentacją strukturalną z wykorzystaniem informacji molekularnych z MSI. Chociaż sam MSI może generować obrazy 3D, obraz jest tylko częścią rzeczywistości ze względu na ograniczenie głębokości analizy, podczas gdy MRI dostarcza na przykład szczegółowego kształtu narządu z dodatkowymi informacjami anatomicznymi. Ta połączona technika może być korzystna w precyzyjnej diagnostyce raka i neurochirurgii.
Przetwarzanie danych
Standardowy format danych dla zestawów danych obrazowania spektrometrii mas
Zaproponowano imzML do wymiany danych w znormalizowanym pliku XML opartym na formacie mzML . Obsługuje go kilka narzędzi oprogramowania MS do przetwarzania obrazu. Zaletą tego formatu jest elastyczność wymiany danych między różnymi instrumentami i oprogramowaniem do analizy danych.
Oprogramowanie
Dostępnych jest wiele bezpłatnych pakietów oprogramowania do wizualizacji i eksploracji danych obrazowania spektrometrii mas. Konwertery z formatu Thermo Fisher, formatu Analyze, formatu GRD i formatu Bruker do formatu imzML zostały opracowane przez projekt Computis. Dostępne są również niektóre moduły oprogramowania do przeglądania obrazów spektrometrii mas w formacie imzML: Biomap (Novartis, bezpłatny), Datacube Explorer (AMOLF, bezpłatny), EasyMSI (CEA), Mirion (JLU), MSiReader (NCSU, bezpłatny) i SpectralAnalysis.
Do przetwarzania plików .imzML za pomocą darmowego języka statystycznego i graficznego R dostępny jest zbiór skryptów R, który umożliwia równoległe przetwarzanie dużych plików na komputerze lokalnym, zdalnym klastrze lub w chmurze Amazon.
Kardynał, istnieje inny darmowy pakiet statystyczny do przetwarzania danych imzML i Analyze 7.5 w R.
SPUTNIK to pakiet R zawierający różne filtry do usuwania pików charakteryzujących się nieskorelowanym rozkładem przestrzennym z położeniem próbki lub losowością przestrzenną .
Aplikacje
Niezwykłą zdolnością MSI jest wykrywanie lokalizacji biomolekuł w tkankach, mimo że nie ma o nich wcześniejszych informacji. Ta cecha uczyniła MSI wyjątkowym narzędziem do badań klinicznych i badań farmakologicznych. Dostarcza informacji o zmianach biomolekularnych związanych z chorobami poprzez śledzenie białek, lipidów i metabolizmu komórkowego. Na przykład identyfikacja biomakerów przez MSI może pokazać szczegółową diagnozę raka. Ponadto można uzyskać tanie obrazowanie do badań farmaceutycznych, takie jak obrazy sygnatur molekularnych, które wskazywałyby na odpowiedź na leczenie dla określonego leku lub skuteczność określonej metody dostarczania leku.
Kolokalizacja jonów była badana jako sposób na wnioskowanie o lokalnych interakcjach między biomolekułami. Podobnie jak w przypadku kolokalizacji w obrazowaniu mikroskopowym , korelacja została wykorzystana do ilościowego określenia podobieństwa między obrazami jonów i wygenerowania modeli sieciowych.
Zalety, wyzwania i ograniczenia
Główną zaletą MSI do badania lokalizacji i dystrybucji cząsteczek w tkance jest to, że ta analiza może zapewnić albo większą selektywność, więcej informacji, albo większą dokładność niż inne. Ponadto narzędzie to wymaga mniejszych nakładów czasu i zasobów, aby uzyskać podobne wyniki. Poniższa tabela przedstawia porównanie zalet i wad niektórych dostępnych technik, w tym MSI, skorelowanych z analizą dystrybucji leku.
| Metodologia | Odpowiedź na pytanie | Zalety | Niedogodności |
|---|---|---|---|
| Autoradiografia | Gdzie i ile radioaktywności | Bardzo wysoka rozdzielczość przestrzenna; wiarygodna ocena ilościowa | ex vivo; wymaga leku radioznakowanego; nie odróżnia leku od metabolitów. |
| Immunohistochemia | Gdzie | Krótki czas przetwarzania; łatwa interpretacja; niedrogi | ex vivo; wymaga przeciwciał, które różnią się czułością i specyficznością; trudności w przypisywaniu; próg detekcji; brak standardowego systemu punktacji |
| Fluorescencja | Gdzie | Możliwe in vivo; rozsądna cena | Nie ilościowe; słaba rozdzielczość; interferencja autofluorescencyjna |
| Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) | Gdzie, co i aktywność | Możliwe in vivo; dobra rozdzielczość; może być połączony z tomografem rentgenowskim, aparatem gamma | Drogi; izotopy krótkotrwałe; potrzebuje cyklotronu do produkcji izotopów |
| Spójny antystokesowski Rozpraszanie Ramana mikroskopia (SAMOCHODY) |
Gdzie i co | Bez etykiet; subkomórkowa rozdzielczość przestrzenna | Nie ilościowe; słaba selektywność; wysoki poziom hałasu w tle |
| Elektrochemiczny atom mikroskop siłowy (AFM) |
Gdzie i co | Obrazowanie bez etykiet; wysoka rozdzielczość | Nie ilościowe; słaba powtarzalność; wysokie tło |
| MSI | Gdzie i co | multipleks; obrazowanie bez etykiet; dobra rozdzielczość przestrzenna | Półilościowe; efekty tłumienia jonów; złożona analiza |
Notatki
Dalsza lektura
„Obrazowanie metali śladowych w systemach biologicznych” s. 81-134 w „Metals, Microbes and Minerals: The Biogeochemical Side of Life” (2021) s. xiv + 341. Autorzy Yu, Jyao; Harankhedkar, Shefali; Nabatilan, Arielle; Fahrni, Krzysztof; Waltera de Gruytera z Berlina. Redaktorzy Kroneck, Peter MH i Sosa Torres, Marta. DOI 10.1515/9783110589771-004