Obrazowanie MALDI

Nerka myszy: ( a ) Widma MALDI z tkanki. (b) Tkanka barwiona H&E. N-glikany przy m/z = 1996,7 (c) znajduje się w korze mózgowej i rdzeniu, podczas gdy m/z = 2158,7 (d) znajduje się w korze mózgowej, (e) Nałożony obraz tych dwóch mas, (f) nietraktowana tkanka kontrolna .

Obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI (MALDI-MSI) polega na wykorzystaniu jonizacji desorpcji laserowej wspomaganej matrycą jako techniki obrazowania spektrometrii mas , w której próbka, często cienki skrawek tkanki , jest przemieszczana w dwóch wymiarach podczas rejestrowania widma masowego . Zalety, takie jak jednoczesny pomiar rozkładu dużej ilości analitów bez niszczenia próbki, sprawiają, że jest to przydatna metoda w badaniach tkankowych.

przygotowanie próbki

Cel do obrazowania MALDI za pomocą dwóch szkiełek mikroskopowych o powierzchni przewodzącej.

Przygotowanie próbki jest kluczowym etapem w spektroskopii obrazowej. Naukowcy pobierają cienkie skrawki tkanki umieszczone na szkiełkach mikroskopu przewodzącego i nakładają na tkankę odpowiednią matrycę MALDI, ręcznie lub automatycznie. Następnie szkiełko mikroskopowe umieszcza się w spektrometrze masowym MALDI. Spektrometr mas rejestruje rozkład przestrzenny cząsteczek, takich jak peptydy, białka czy małe cząsteczki. Do importowania danych ze spektrometru mas można użyć odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby umożliwić wizualizację i porównanie z optycznym obrazem próbki. Niedawne prace wykazały również zdolność do tworzenia trójwymiarowych obrazów molekularnych przy użyciu technologii obrazowania MALDI i porównania tych objętości obrazu z innymi metodami obrazowania, takimi jak rezonans magnetyczny ( MRI ).

Przygotowanie tkanki

Próbki tkanek należy szybko zakonserwować, aby ograniczyć degradację molekularną. Pierwszym krokiem jest zamrożenie próbki poprzez owinięcie próbki, a następnie zanurzenie jej w roztworze kriogenicznym. Po zamrożeniu próbki można przechowywać w temperaturze poniżej -80°C przez okres do jednego roku. Gotowa do analizy tkanka jest osadzona w podłożu żelatynowym, które podtrzymuje tkankę podczas jej cięcia, jednocześnie redukując zanieczyszczenie, które obserwuje się w technikach łączenia w optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Grubość zamontowanego skrawka tkanki różni się w zależności od tkanki.

Skrawki tkanek można następnie rozmrozić, umieszczając próbkę na powierzchni przewodzącego szkiełka o tej samej temperaturze, a następnie powoli ogrzewając od dołu. Skrawek można również przykleić do powierzchni ciepłego szkiełka, powoli opuszczając szkiełka na zimną próbkę, aż próbka przylgnie do powierzchni.

Próbkę można następnie zabarwić w celu łatwego namierzenia interesujących obszarów i poddać wstępnej obróbce przez przemycie w celu usunięcia gatunków, które tłumią interesujące cząsteczki. Płukanie różnymi stopniami etanolu usuwa lipidy z tkanek o wysokim stężeniu lipidów z niewielką delokalizacją i utrzymuje integralność przestrzennego rozmieszczenia peptydów w próbce.

( a ) Tkanka płuc szczura, ( be ) dystrybucja czterech różnych fosfatydylocholin obecnych w ( a )

Aplikacja matrycy

Matryca musi absorbować przy długości fali lasera i jonizować analit. Wybór matrycy i system rozpuszczalników w dużej mierze opiera się na klasie analitów pożądanej w obrazowaniu. Analit musi być rozpuszczalny w rozpuszczalniku w celu wymieszania i rekrystalizacji matrycy. Matryca musi mieć jednorodną powłokę, aby zwiększyć czułość, intensywność i powtarzalność strzału. Podczas nakładania matrycy stosuje się minimalną ilość rozpuszczalnika, aby uniknąć delokalizacji.

Jedną z technik jest opryskiwanie. Matrycę rozpyla się w postaci bardzo małych kropelek na powierzchnię próbki, pozostawia do wyschnięcia i ponownie pokrywa, aż do uzyskania wystarczającej ilości matrycy do analizy próbki. Wielkość kryształów zależy od zastosowanego układu rozpuszczalników.

Sublimację można również stosować do wykonywania jednolitych powłok matrycowych o bardzo małych kryształach. Matrycę umieszcza się w komorze sublimacyjnej z zamontowaną próbką tkanki odwróconą nad nią. Ciepło jest przykładane do matrycy, powodując jej sublimację i kondensację na powierzchni próbki. Kontrolowanie czasu ogrzewania kontroluje grubość matrycy na próbce i wielkość utworzonych kryształów.

Zautomatyzowane spottery są również używane do regularnego umieszczania kropelek w próbce tkanki. Rozdzielczość obrazu zależy od rozstawu kropelek.

Produkcja obrazu

Obrazy są konstruowane przez wykreślenie intensywności jonów w funkcji względnej pozycji danych z próbki. Rozdzielczość przestrzenna ma duży wpływ na informacje molekularne uzyskane z analizy.

Aplikacje

MALDI-MSI obejmuje wizualizację przestrzennego rozmieszczenia białek, peptydów, lipidów i innych małych cząsteczek w cienkich skrawkach tkanki, takiej jak zwierzęca lub roślinna. Zastosowanie tej techniki w badaniach biologicznych znacznie wzrosło od czasu jej wprowadzenia. MALDI-MSI wnosi znaczący wkład w zrozumienie chorób, poprawę diagnostyki i dostarczanie leków. Znaczące badania dotyczą oka, badań nad rakiem, dystrybucji leków i neuronauki.

MALDI-MSI jest w stanie rozróżnić leki i metabolity oraz dostarczyć informacji histologicznych w badaniach nad rakiem, co czyni go obiecującym narzędziem do znajdowania nowych biomarkerów białkowych. Jednak może to być trudne ze względu na supresję jonów , słabą jonizację i efekty fragmentacji matrycy o niskiej masie cząsteczkowej. Aby temu zaradzić, stosuje się derywatyzację chemiczną w celu poprawy wykrywania.

Zobacz też

Dalsza lektura

Francese S, Dani FR, Traldi P, Mastrobuoni G, Pieraccini G, Moneti G (luty 2009). „Obrazowanie spektrometrią mas MALDI, od jego początków do dziś: stan techniki” . Grzebień. chemia Ekran o wysokiej przepustowości . 12 (2): 156–74. doi : 10.2174/138620709787315454 . PMID 19199884 .
Richarda M. Caprioli; Terry B. Farmer i Jocelyn Gile (grudzień 1997). „Obrazowanie molekularne próbek biologicznych: lokalizacja peptydów i białek przy użyciu MALDI-TOF MS”. Analny. chemia . 69 (23): 4751–4760. doi : 10.1021/ac970888i . PMID 9406525 .

Linki zewnętrzne