Supresja jonowa w chromatografii cieczowej – spektrometria mas

Supresja jonów w LC-MS i LC-MS/MS odnosi się do zmniejszonej odpowiedzi detektora lub sygnału: szumu jako przejawu rywalizacji o wydajność jonizacji w źródle jonizacji , między badanym analitem a innymi endogennymi lub egzogennymi ( np. plastyfikatory ekstrahowane z plastikowych probówek, dodatki do fazy ruchomej) gatunki, które nie zostały usunięte z matrycy próbki podczas jej przygotowania . Supresja jonów nie jest ściśle problemem, chyba że związki zakłócające eluują się w tym samym czasie co analit będący przedmiotem zainteresowania. W przypadkach, gdy cząsteczki tłumiące jony eluują wspólnie z analitem, wpływ na ważne parametry analityczne, w tym precyzję, dokładność i granicę wykrywalności (czułość analityczna), może być znaczny, poważnie ograniczając ważność wyników testu.

Historia

Na początku jako narzędzie chemii analitycznej , LC-MS/MS rozprzestrzeniało się szybko i rzeczywiście nadal to robi w (między innymi) dziedzinach bioanalitycznych , ze względu na swoją selektywność względem interesujących analitów. Rzeczywiście, w wielu przypadkach ta selektywność może prowadzić do błędnego przekonania, że ​​zawsze można uprościć lub (czasami) prawie całkowicie wyeliminować konieczność szczegółowego przygotowania próbki. W rezultacie LC-MS/MS stała się narzędziem analitycznym wybieranym do bioanalizy ze względu na imponującą czułość i selektywność w porównaniu z innymi, bardziej konwencjonalnymi metodami chromatograficznymi. Jednak w trakcie i po pobraniu przez laboratoria bioanalityczne na całym świecie stało się oczywiste, że istnieją nieodłączne problemy z wykrywaniem stosunkowo małych stężeń analitów w złożonych matrycach próbek związanych z płynami biologicznymi (np. krwią i moczem).

Proponowane mechanizmy supresji jonowej

Mówiąc prościej, supresja jonowa opisuje niekorzystny wpływ na odpowiedź detektora ze względu na zmniejszoną wydajność jonizacji analitów będących przedmiotem zainteresowania, wynikający z obecności w matrycy próbki związków, które konkurują o jonizację lub hamują wydajną jonizację w inny sposób. Użycie MS/MS jako środka do wykrywania może sprawiać wrażenie, że nie występują żadne substancje przeszkadzające, ponieważ nie wykrywa się żadnych zanieczyszczeń chromatograficznych. Jednak gatunki, które nie są izobaryczne, mogą nadal mieć niekorzystny wpływ na czułość, dokładność i precyzję testu ze względu na tłumienie jonizacji analitu będącego przedmiotem zainteresowania.

Chociaż dokładne chemiczne i fizyczne czynniki związane z supresją jonów nie są w pełni zrozumiałe, zaproponowano, że zasadowość, wysokie stężenie, masa i bardziej intuicyjnie współwymywanie z interesującym analitem to czynniki, których nie należy ignorować.

Najbardziej powszechnymi technikami jonizacji pod ciśnieniem atmosferycznym stosowanymi w LC-MS/MS są jonizacja przez elektrorozpylanie (ESI) i jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI). APCI jest mniej podatny na wyraźne tłumienie jonów niż ESI, co jest nieodłączną właściwością odpowiednich mechanizmów jonizacji.

W APCI jedyne źródło supresji jonów można przypisać zmianie właściwości koligatywnych substancji rozpuszczonej podczas odparowywania (King i in., J. Am. Soc. Mass Spectrom 2000, 11, 942-950).

ESI ma bardziej złożony mechanizm jonizacji, w dużej mierze polegający na nadmiarze ładunku kropelkowego, dlatego przy badaniu przyczyny supresji jonów należy wziąć pod uwagę znacznie więcej czynników. Powszechnie zaobserwowano, że w przypadku wielu analitów, przy wysokich stężeniach, ESI wykazuje utratę liniowości odpowiedzi detektora , być może z powodu zmniejszonego nadmiaru ładunku spowodowanego nasyceniem analitu na powierzchni kropli, hamując późniejszy wyrzut jonów fazy gazowej z głębi kropli . Zatem współzawodnictwo o przestrzeń i/lub ładunek można uznać za źródło supresji jonów w ESI. Zarówno właściwości fizyczne, jak i chemiczne analitów (np. zasadowość i aktywność powierzchniowa) determinują ich naturalną wydajność jonizacji. Matryce próbek biologicznych w naturalny sposób zawierają wiele gatunków endogennych o wysokiej zasadowości i aktywności powierzchniowej, stąd całkowite stężenie tych gatunków w próbce szybko osiągnie poziomy, przy których należy spodziewać się supresji jonów.

Inne wyjaśnienie supresji jonów w ESI uwzględnia właściwości fizyczne samej kropelki, a nie obecny gatunek. Wysokie stężenia składników zakłócających powodują wzrost napięcia powierzchniowego i lepkości, powodując zmniejszenie desolwatacji (parowania rozpuszczalnika), o której wiadomo, że ma wyraźny wpływ na wydajność jonizacji.

Trzecia proponowana teoria supresji jonów w ESI dotyczy obecności substancji nielotnych , które mogą albo powodować współstrącanie analitu w kropli (zapobiegając w ten sposób jonizacji), albo zapobiegać zmniejszaniu się rozmiaru kropel do krytycznego promienia wymaganego dla jonu mechanizmy parowania i/lub pozostałości ładunku w celu wydajnego tworzenia jonów w fazie gazowej.

Warto wziąć pod uwagę, że stopień supresji jonów może być zależny od stężenia monitorowanego analitu. Wyższy stosunek analit/matryca może dać mniejszy efekt supresji jonów.

Ocena supresji jonowej podczas walidacji metody

Ponieważ przyjmuje się, że supresja jonów może potencjalnie wpływać na inne parametry analityczne dowolnego testu, rozważne podejście do opracowywania każdej metody LC-MS powinno obejmować ocenę supresji jonów. Istnieją dwa akceptowane protokoły, za pomocą których można to osiągnąć, opisane poniżej.

Monitorowanie odpowiedzi detektora przy ciągłym wlewie

Bardziej kompleksowe podejście do oceny supresji jonów polega na ciągłym wprowadzaniu odpowiedniego stężenia do przepływu fazy ruchomej, za kolumną analityczną, przy użyciu pompy strzykawkowej i trójnika. Typową próbkę należy następnie wstrzyknąć przez HPLC zgodnie ze zwykłymi parametrami analitycznymi.

Monitorowanie odpowiedzi detektora podczas tego eksperymentu powinno dawać stały sygnał odpowiedni do stężenia podawanych gatunków. Po wstrzyknięciu próbki należy zaobserwować spadek intensywności sygnału (lub odpowiedź negatywną) za każdym razem, gdy gatunek jest jonizowany w źródle jonów. Powinno to pozwolić na określenie czasu retencji każdego takiego gatunku w ramach parametrów analitycznych testu. Każdy gatunek powodujący odpowiedź negatywną można uznać za przyczyniający się do supresji jonów, ale tylko wtedy, gdy taki gatunek eluuje wspólnie z analitem będącym przedmiotem zainteresowania.

Należy również wziąć pod uwagę, że związki przyczyniające się do supresji jonów mogą być zatrzymywane przez kolumnę w znacznie większym stopniu niż badany analit. W tym celu odpowiedź detektora powinna być monitorowana przez kilka razy dłużej niż zwykły czas przebiegu chromatografii, aby upewnić się, że tłumienie jonów nie wpłynie na kolejne nastrzyki.

Przygotowanie wzbogaconych próbek osocza

Innym podejściem do oceny tłumienia jonów jest porównanie między:

• Reakcja detektora na wzorzec kalibracyjny (wodny lub w innym odpowiednim rozpuszczalniku) — daje to najlepszy scenariusz odpowiedzi detektora, tj. w warunkach zerowej supresji jonów
• Wstępnie przygotowana matryca próbki wzbogacona identycznym stężeniem analitu — demonstruje to efekt supresji jonów
• Reakcja detektora matrycy próbki wzbogaconej identycznym stężeniem analitu i poddanej zwykłej procedurze przygotowania próbki — może to pokazać różnicę między jakąkolwiek utratą sygnału spowodowaną niedostatecznym odzyskiem podczas procesu przygotowania próbki a rzeczywistą supresją jonów

Podejścia do negowania supresji jonów

Istnieje kilka strategii usuwania i/lub negowania supresji jonów. Podejścia te mogą wymagać dogłębnego zrozumienia mechanizmów jonizacji związanych z różnymi źródłami jonizacji lub mogą być całkowicie niezależne od zaangażowanych czynników fizycznych.

Separacja chromatograficzna

Jeżeli separację chromatograficzną można zmodyfikować, aby zapobiec koelucji związków tłumiących, nie trzeba rozważać innych podejść. Efekt modyfikacji chromatograficznej można ocenić stosując opisane wcześniej monitorowanie odpowiedzi detektora w podejściu ze stałą infuzją.

przygotowanie próbki

Skuteczny protokół przygotowania próbki, zwykle obejmujący ekstrakcję ciecz-ciecz (LLE) lub ekstrakcję do fazy stałej (SPE) i często derywatyzację , może usunąć cząsteczki hamujące jony z matrycy próbki przed analizą. Te wspólne podejścia mogą również usuwać inne zakłócenia, takie jak gatunki izobaryczne.

Wytrącanie białek to kolejna metoda, którą można zastosować do analizy małych cząsteczek. Usunięcie wszystkich rodzajów białek z matrycy próbki może być skuteczne w niektórych przypadkach, chociaż w przypadku wielu analitów związki tłumiące jony nie są pochodzenia białkowego, dlatego technika ta jest często stosowana w połączeniu z ekstrakcją i derywatyzacją.

Stężenie próbki i szybkość przepływu fazy ruchomej

Rozcieńczenie próbki lub zmniejszenie objętości wstrzykniętej próbki może zmniejszyć supresję jonów poprzez zmniejszenie ilości obecnych związków zakłócających, chociaż ilość interesującego analitu również zostanie zmniejszona, co czyni to podejście niepożądanym w przypadku analizy śladowej.

Podobny jest efekt zmniejszenia szybkości przepływu fazy ruchomej do zakresu nanolitrów na minutę, ponieważ oprócz poprawy desolwatacji, utworzone mniejsze kropelki są bardziej tolerancyjne na obecność substancji nielotnych w matrycy próbki.

Techniki kalibracji w celu kompensacji tłumienia jonów

Nie zawsze możliwe jest wyeliminowanie supresji jonów poprzez przygotowanie próbki i/lub rozdzielczość chromatograficzną. W takich przypadkach możliwe może być zrekompensowanie wpływu tłumienia jonów na dokładność i precyzję (choć nie na czułość analityczną) poprzez przyjęcie złożonych strategii kalibracji.

Standardy kalibracji zgodne z matrycą

Użycie wzorców kalibracji dopasowanych do matrycy może zrekompensować tłumienie jonów. Wykorzystując tę ​​technikę, wzorce kalibracyjne są przygotowywane w identycznej matrycy próbki, jak ta używana do analizy (np. osocze), poprzez dodanie do normalnej próbki znanego stężenia analitu. Nie zawsze jest to możliwe w przypadku próbek biologicznych, ponieważ interesujący analit jest często endogennie obecny w klinicznie istotnej, choć normalnej, ilości. Aby wzorce kalibracji dopasowane do matrycy skutecznie kompensowały supresję jonów, matryca próbki musi być wolna od analitu będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto ważne jest, aby występowały niewielkie różnice w składzie próbki testowej, ponieważ zarówno próbka testowa, jak i przygotowana próbka kalibracyjna muszą w ten sam sposób wpływać na supresję jonów. Ponownie, w złożonych próbkach biologicznych od różnych osobników, a nawet od tego samego osobnika w różnym czasie, mogą występować duże fluktuacje stężeń związków tłumiących jony.

Standardowy dodatek

Podejście polegające na dodawaniu standardowym obejmuje wzbogacanie tego samego ekstraktu próbki kilkoma znanymi stężeniami analitu. Ta technika jest bardziej niezawodna i skuteczna niż stosowanie wzorców dopasowanych do matrycy, ale jest pracochłonna, ponieważ każda próbka musi być przygotowywana kilka razy, aby uzyskać wiarygodną kalibrację.

Wzorzec wewnętrzny

W tym podejściu próbka jest wzbogacana gatunkiem ( wzorcem wewnętrznym ), który służy do normalizacji odpowiedzi analitu, kompensując zmienne na każdym etapie przygotowania i analizy próbki, w tym supresję jonową.

Ważne jest, aby wzorzec wewnętrzny wykazywał bardzo podobne (idealnie identyczne) właściwości pod względem odpowiedzi detektora (tj. jonizacji), jak badany analit. Aby uprościć wybór wzorca wewnętrznego, większość laboratoriów stosuje analogiczny stabilny izotop w rozcieńczeniu izotopowym analiza typu. Prawie gwarantuje się, że stabilny izotop będzie pod względem chemicznym i fizycznym jak najbardziej zbliżony do interesującego nas analitu, a tym samym zapewni prawie identyczną odpowiedź detektora, a ponadto będzie zachowywał się identycznie podczas przygotowywania próbki i rozdzielania chromatograficznego. W tym celu tłumienie jonów doświadczane zarówno przez analit, jak i wzorzec wewnętrzny powinno być identyczne. Należy zauważyć, że zbyt wysokie stężenie standardu wewnętrznego stabilnego izotopu może spowodować samo supresję jonów, ponieważ będzie on eluował razem z badanym analitem. Dlatego wzorzec wewnętrzny powinien być dodany w odpowiednim stężeniu.

Wybór źródła jonizacji

APCI na ogół cierpi na mniejszą supresję jonów niż ESI, jak omówiono wcześniej. Tam, gdzie to możliwe, jeśli supresja jonów jest nieunikniona, może być wskazane przejście z ESI na APCI. Jeśli nie jest to możliwe, przydatne może być przełączenie trybu jonizacji ESI z dodatniego na ujemny. Ponieważ mniej związków ulega jonizacji w trybie jonizacji ujemnej, jest całkiem możliwe, że cząsteczki tłumiące jony mogą zostać usunięte z analizy. Należy jednak również wziąć pod uwagę, że interesujący analit może nie być skutecznie jonizowany również w trybie ujemnym, co czyni to podejście bezużytecznym.