Wytrącanie białek

Wytrącanie białek jest szeroko stosowane w dalszym przetwarzaniu produktów biologicznych w celu zagęszczenia białek i oczyszczenia ich z różnych zanieczyszczeń. Na przykład w biotechnologicznym wytrącanie białek stosuje się w celu wyeliminowania zanieczyszczeń powszechnie zawartych we krwi. Podstawowym mechanizmem wytrącania jest zmiana potencjału solwatacji rozpuszczalnika, a dokładniej, poprzez obniżenie rozpuszczalności substancji rozpuszczonej przez dodanie odczynnika.

Ogólne zasady

Rozpuszczalność białek w buforach wodnych zależy od rozmieszczenia hydrofilowych i hydrofobowych reszt aminokwasowych na powierzchni białka. Reszty hydrofobowe występują głównie w globularnym rdzeniu białkowym, ale niektóre występują w plamach na powierzchni. Białka o dużej zawartości hydrofobowych aminokwasów na powierzchni mają słabą rozpuszczalność w rozpuszczalniku wodnym. Naładowane i polarne reszty powierzchniowe oddziałują z grupami jonowymi w rozpuszczalniku i zwiększają rozpuszczalność białka. Znajomość składu aminokwasowego białka pomoże w określeniu idealnego rozpuszczalnika i metod wytrącania.

Odpychająca siła elektrostatyczna

Odpychające siły elektrostatyczne powstają, gdy białka rozpuszczają się w roztworze elektrolitu . Te siły odpychające między białkami zapobiegają agregacji i ułatwiają rozpuszczanie. Po rozpuszczeniu w roztworze elektrolitu przeciwjony rozpuszczalnika migrują w kierunku naładowanych reszt powierzchniowych białka, tworząc sztywną matrycę przeciwjonów na powierzchni białka. Obok tej warstwy znajduje się kolejna warstwa solwatacyjna, która jest mniej sztywna i w miarę oddalania się od powierzchni białka zawiera malejące stężenie przeciwjonów i rosnące stężenie kojonów. Obecność tych warstw solwatacyjnych powoduje, że białko ma mniej interakcji jonowych z innymi białkami i zmniejsza prawdopodobieństwo agregacji. Odpychające siły elektrostatyczne powstają również podczas rozpuszczania białek w wodzie. Woda tworzy warstwę solwatacyjną wokół hydrofilowych reszt powierzchniowych białka. Woda tworzy gradient stężeń wokół białka, przy czym najwyższe stężenie występuje na powierzchni białka. Ta sieć wodna ma działanie tłumiące siły przyciągania pomiędzy białkami.

Warstwa solwatacyjna jonowa
Warstwa nawilżająca

Atrakcyjna siła elektrostatyczna

Pomiędzy białkami istnieją siły dyspersyjne lub przyciągające poprzez dipole trwałe i indukowane . Na przykład reszty zasadowe na białku mogą oddziaływać elektrostatycznie z resztami kwasowymi na innym białku. Jednakże solwatacja jonami w roztworze elektrolitu lub wodzie zmniejszy siły przyciągania białko-białko. Dlatego, aby wytrącić lub wywołać akumulację białek, należy zmniejszyć warstwę hydratacyjną wokół białka. Celem dodanych odczynników podczas wytrącania białek jest zmniejszenie warstwy hydratacyjnej.

Warstwa nawilżająca

Tworzenie się osadu

Tworzenie się osadu białka zachodzi w procesie etapowym. Najpierw dodaje się środek strącający i roztwór stale miesza. Mieszanie powoduje zderzenie środka strącającego i białka. Wymagany jest wystarczający czas mieszania, aby cząsteczki mogły dyfundować przez wiry płynu. Następnie białka przechodzą zarodkowania , podczas której powstają agregaty białkowe lub cząstki o submikroskopowych rozmiarach. Wzrost tych cząstek podlega kontroli dyfuzji Browna. Gdy cząstki osiągną rozmiar krytyczny (0,1 µm do 10 µm dla wysokiego i niskiego ścinania) . pola), poprzez dyfuzyjne dodawanie do niego poszczególnych cząsteczek białka, nadal rosną, zderzając się ze sobą i sklejając lub flokulując . Faza ta przebiega wolniej. Podczas ostatniego etapu, zwanego starzeniem w polu ścinania, wytrącone cząstki wielokrotnie zderzają się i sklejają, a następnie rozpadają, aż do osiągnięcia stabilnej średniej wielkości cząstek, która jest zależna od poszczególnych białek. Wytrzymałość mechaniczna cząstek białka koreluje z iloczynem średniej szybkości ścinania i czasu starzenia, który jest znany jako liczba Camp. Starzenie się pomaga cząstkom wytrzymać siły ścinające płynu występujące w pompach i strefach zasilania wirówek, bez zmniejszania rozmiaru.

Metody

Solenie

Wysalanie jest najpowszechniejszą metodą stosowaną do wytrącania białka. Dodatek soli obojętnej, takiej jak siarczan amonu , ściska warstwę solwatacyjną i zwiększa interakcje białko-białko. W miarę wzrostu stężenia soli w roztworze ładunki na powierzchni białka oddziałują z solą, a nie z wodą, odsłaniając w ten sposób plamy hydrofobowe na powierzchni białka i powodując wypadanie białka z roztworu (agregat i osad).

Energetyka związana z wysalaniem

Wysalanie jest procesem samoistnym , po osiągnięciu odpowiedniego stężenia soli w roztworze. Hydrofobowe plamy na powierzchni białka tworzą wysoce uporządkowane powłoki wodne. Powoduje to niewielki spadek entalpii ΔH i większy spadek entropii ΔS uporządkowanych cząsteczek wody w stosunku do cząsteczek w roztworze masowym . Całkowita zmiana energii swobodnej Δ G procesu jest określona równaniem energii swobodnej Gibbsa:

{\ Displaystyle \ Delta G = \ Delta HT \ Delta S.}

Δ G = zmiana energii swobodnej, Δ H = zmiana entalpii po opadach, Δ S = zmiana entropii po opadach, T = temperatura bezwzględna. Kiedy cząsteczki wody w sztywnej warstwie solwatacyjnej zostaną sprowadzone z powrotem do fazy masowej w wyniku interakcji z dodaną solą, ich większa swoboda ruchu powoduje znaczny wzrost ich entropii. Zatem Δ G staje się ujemne i opady zachodzą samoistnie.

Seria Hofmeistera

Kosmotropy lub „stabilizatory struktury wody” to sole, które wspomagają rozpraszanie/dyspergację wody z warstwy solwatacyjnej wokół białka. Następnie na powierzchni białka eksponowane są plamy hydrofobowe, które oddziałują z plamami hydrofobowymi na innych białkach. Sole te zwiększają agregację i wytrącanie białek. Chaotropy, czyli „łamacze struktury wody”, mają odwrotny efekt do kosmotropów. Sole te sprzyjają wzrostowi warstwy solwatacyjnej wokół białka. Skuteczność soli kosmotropowych w wytrącaniu białek jest zgodna z szeregiem Hofmeistera:

Najwięcej opadów ${\ Displaystyle \ operatorname {PO_ {4} ^ {3-}> SO_ {4} ^ {2-}> COO ^ {-}>Cl^{-}} }$ najmniejsze opady

Najwięcej opadów ${\ Displaystyle \ operatorname {NH_ {4} ^ {+}> K ^ {+}> Na ^ {+}} }$ najmniejsze opady

Solenie w praktyce

Spadek rozpuszczalności białka przebiega według znormalizowanej krzywej rozpuszczalności przedstawionego typu. Zależność pomiędzy rozpuszczalnością białka a rosnącą siłą jonową roztworu można przedstawić za pomocą Cohna :

{\ Displaystyle \ log S = B-KI \,}

S = rozpuszczalność białka, B to wyidealizowana rozpuszczalność, K to stała specyficzna dla soli, a I to siła jonowa roztworu przypisywana dodanej soli.

${\ Displaystyle ja = {\ początek {macierz} {\ Frac {1} {2}} \ koniec {macierz}} \ suma _ {i = 1} ^ {n}c_{i}z_{i}^{2}}$

z _i to ładunek jonowy soli, a _ci to stężenie soli. Idealna sól do wytrącania białek jest najskuteczniejsza dla określonego składu aminokwasów, jest niedroga, niebuforuje i nie zanieczyszcza środowiska. Najczęściej stosowaną solą jest siarczan amonu . Występuje niewielka zmienność wysalania w temperaturach od 0 °C do 30 °C. Osad białka pozostawiony w roztworze soli może pozostać stabilny przez lata, chroniony przed proteolizą i zanieczyszczeniem bakteryjnym w wyniku wysokiego stężenia soli.

Krzywa rozpuszczalności

Opady izoelektryczne

Punkt izoelektryczny (pI) to pH roztworu, przy którym ładunek pierwotny białka wynosi zero. Przy pH roztworu wyższym od pI powierzchnia białka jest przeważnie naładowana ujemnie i dlatego podobnie naładowane cząsteczki będą wykazywały siły odpychające. Podobnie, przy pH roztworu niższym od pI, powierzchnia białka jest przeważnie naładowana dodatnio i następuje odpychanie między białkami. Jednakże przy pI ładunki ujemne i dodatnie znoszą się, odpychające siły elektrostatyczne zmniejszają się i przeważają siły przyciągania. Siły przyciągania spowodują agregację i wytrącanie. Wartość pH większości białek mieści się w zakresie pH 4–6. Kwasy mineralne, np Jako środki strącające stosuje się kwas solny i siarkowy. Największą wadą wytrącania w punkcie izoelektrycznym jest nieodwracalna denaturacja spowodowana kwasami mineralnymi. Z tego powodu wytrącanie w punkcie izoelektrycznym jest najczęściej stosowane do wytrącania białek zanieczyszczających, a nie białka docelowego. Wytrącanie kazeiny podczas produkcji sera lub podczas produkcji kazeinianu sodu jest wytrącaniem izoelektrycznym.

Wytrącanie za pomocą mieszalnych rozpuszczalników

Dodanie mieszalnych rozpuszczalników, takich jak etanol lub metanol , do roztworu może spowodować wytrącenie się białek w roztworze. Warstwa solwatacyjna wokół białka będzie się zmniejszać, gdy rozpuszczalnik organiczny stopniowo wypiera wodę z powierzchni białka i wiąże ją w warstwach hydratacyjnych wokół cząsteczek rozpuszczalnika organicznego. Przy mniejszych warstwach hydratacyjnych białka mogą agregować pod wpływem przyciągających sił elektrostatycznych i dipolowych. Ważnymi parametrami, które należy wziąć pod uwagę, jest temperatura, która powinna być niższa niż 0 °C, aby uniknąć denaturacji , pH i stężenie białka w roztworze. Mieszalne rozpuszczalniki organiczne zmniejszają stałą dielektryczną wody, co w efekcie pozwala na zbliżenie się dwóch białek. W punkcie izoelektrycznym zależność między stałą dielektryczną a rozpuszczalnością białka wyraża się wzorem:

{\ Displaystyle \ log S = k / e ^ {2} + \ log S ^ {0} \,}

⁰ S jest ekstrapolowaną wartością S , e jest stałą dielektryczną mieszaniny, a k jest stałą związaną ze stałą dielektryczną wody. Proces Cohna frakcjonowania białek osocza polega na wytrącaniu rozpuszczalnika etanolem w celu wyizolowania poszczególnych białek osocza.

Klinicznym zastosowaniem metanolu jako środka wytrącającego białka jest oznaczanie bilirubiny.

Niejonowe polimery hydrofilowe

Polimery , takie jak dekstrany i glikole polietylenowe , są często stosowane do wytrącania białek, ponieważ mają niską palność i rzadziej powodują denaturację biomateriałów niż wytrącanie izoelektryczne. Te polimery w roztworze przyciągają cząsteczki wody z dala od warstwy solwatacyjnej wokół białka. Zwiększa to interakcje białko-białko i zwiększa wytrącanie. W konkretnym przypadku glikolu polietylenowego wytrącanie można modelować za pomocą równania:

pS = X-aC \,}

C to stężenie polimeru, P to współczynnik interakcji białko-białko, a to współczynnik interakcji białko-polimer i

{\ Displaystyle x = (\ mu _ {i} - \ mu _ {i} ^ {0}) RT}

μ to potencjał chemiczny składnika I, R to uniwersalna stała gazowa , a T to temperatura bezwzględna.

Flokulacja przez polielektrolity

Alginian , karboksymetyloceluloza, kwas poliakrylowy, kwas garbnikowy i polifosforany mogą tworzyć rozszerzone sieci między cząsteczkami białka w roztworze. Skuteczność tych polielektrolitów zależy od pH roztworu. Anionowe polielektrolity stosuje się przy wartościach pH niższych niż punkt izoelektryczny. Kationowe polielektrolity mają wartości pH powyżej pI. Należy pamiętać, że nadmiar polielektrolitów spowoduje ponowne rozpuszczenie osadu w roztworze. Przykładem flokulacji polielektrolitu jest usuwanie chmury białka z brzeczki piwnej za pomocą mchu irlandzkiego .

Wielowartościowe jony metali

Sole metali można stosować w niskich stężeniach do wytrącania enzymów i kwasów nukleinowych z roztworów. Często stosowanymi jonami metali wielowartościowych są Ca ²⁺ , Mg ²⁺ , Mn ²⁺ lub Fe ²⁺ .

Reaktory strącające

roztworu dużych ilości białek, takich jak rekombinowane polimerazy DNA . [1]

Reaktory wsadowe

Reaktory wsadowe są najprostszym rodzajem reaktorów strącających. Do roztworu białka powoli dodaje się środek strącający, mieszając. Agregujące cząstki białka są zwykle zwarte i mają regularny kształt. Ponieważ cząstki są poddawane działaniu szerokiego zakresu naprężeń ścinających przez długi okres czasu, wydają się być zwarte, gęste i stabilne mechanicznie.

Reaktory rurowe

W reaktorach rurowych roztwór białka zasilającego i odczynnik wytrącający kontaktuje się w strefie efektywnego mieszania, a następnie wprowadza do długich rur, gdzie następuje wytrącanie. Elementy objętościowe płynu zbliżają się do przepływu tłokowego , gdy przemieszczają się przez rury reaktora. Przepływ turbulentny jest wspomagany przez wstawki z siatki drucianej w rurze. Reaktor rurowy nie wymaga ruchomych części mechanicznych i jest tani w budowie. Jednakże reaktor może stać się niepraktycznie długi, jeśli cząstki agregują powoli.

Reaktory zbiornikowe z ciągłym mieszaniem (CSTR)

CSTR pracują w stanie ustalonym z ciągłym przepływem reagentów i produktów w dobrze wymieszanym zbiorniku. Świeża pasza białkowa styka się z zawiesiną , która zawiera już cząstki osadu i odczynniki strącające.

Zellnera; i in. (czerwiec 2005). „Ilościowa walidacja różnych metod wytrącania białek w analizie proteomu płytek krwi”. Elektroforeza . 26 (12): 2481–9. doi : 10.1002/elps.200410262 . PMID 15895463 .
Harrison i in., Bioseparations Science and Engineering. Wydawnictwo Uniwersytetu Oksfordzkiego. Nowy Jork, Nowy Jork 2003.
Shuler i in., Inżynieria bioprocesowa: podstawowe koncepcje (wydanie 2). Międzynarodowy Prentice Hall. 2001
Ladisch. Inżynieria Bioseparacji . John Wiley & Sons, Inc. Nowy Jork, Nowy Jork 2001.
Lydersena. Inżynieria Bioprocesowa. John Wiley & Sons, Inc. Nowy Jork, Nowy Jork 1994.
Belter, Paul A. Bioseparations: dalsze przetwarzanie dla biotechnologii. John Wiley & Sons, Inc. Nowy Jork, Nowy Jork 1988.