Obrazowanie pojedynczych komórek na żywo

W biologii systemowej obrazowanie pojedynczych komórek na żywo jest techniką obrazowania żywych komórek , która łączy tradycyjne techniki obrazowania żywych komórek i mikroskopii poklatkowej ze zautomatyzowanym śledzeniem komórek i ekstrakcją cech, wykorzystując wiele technik z badań przesiewowych o dużej zawartości . Służy do badania dynamiki i zachowania sygnalizacji w populacjach poszczególnych żywych komórek. Badania żywych pojedynczych komórek mogą ujawnić kluczowe zachowania, które w przeciwnym razie byłyby maskowane w eksperymentach uśredniania populacji, takich jak Western blot .

W eksperymencie obrazowania pojedynczej żywej komórki reporter fluorescencyjny jest wprowadzany do linii komórkowej w celu zmierzenia poziomów, lokalizacji lub aktywności cząsteczki sygnałowej. Następnie obrazuje się populację komórek w czasie przy starannej kontroli atmosfery, aby zachować żywotność i zmniejszyć stres wywierany na komórki. Następnie przeprowadza się automatyczne śledzenie komórek na tych obrazach szeregów czasowych, po czym można przeprowadzić filtrowanie i kontrolę jakości. Analiza cech opisujących reporter fluorescencyjny w czasie może następnie prowadzić do modelowania i generowania wniosków biologicznych, na podstawie których można kierować dalszymi eksperymentami.

Historia

Dziedzina obrazowania żywych pojedynczych komórek rozpoczęła się od prac wykazujących, że białko zielonej fluorescencji (GFP), znalezione w meduzie Aequorea victoria , może ulegać ekspresji w żywych organizmach. Odkrycie to umożliwiło naukowcom zbadanie lokalizacji i poziomów białek w żywych pojedynczych komórkach, na przykład aktywności kinaz i poziomów wapnia , za pomocą reporterów FRET , a także wielu innych fenotypów.

Ogólnie rzecz biorąc, te wczesne badania koncentrowały się na lokalizacji i zachowaniu tych białek znakowanych fluorescencyjnie na poziomie subkomórkowym w krótkich okresach czasu. Zmieniło się to jednak wraz z pionierskimi badaniami nad supresorem guza p53 oraz białkiem NF-κB związanym ze stresem i stanem zapalnym , ujawniając tam poziomy i lokalizację odpowiednio do oscylacji w okresach kilku godzin. Mniej więcej w tym czasie zastosowano również podejście oparte na żywych pojedynczych komórkach, aby zrozumieć sygnalizację w organizmach jednokomórkowych, w tym w bakteriach, gdzie badania na żywo umożliwiły modelowanie dynamiki kompetencji, a drożdże ujawniły mechanizm leżący u podstaw spójnego wejścia w cykl komórkowy.

Eksperymentalny przepływ pracy

Reporterzy fluorescencyjni

W każdym badaniu pojedynczej żywej komórki pierwszym krokiem jest wprowadzenie reportera dla naszego białka/cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania do odpowiedniej linii komórkowej. Znaczna część wzrostu w tej dziedzinie pochodzi z ulepszonych narzędzi do edycji genów, takich jak CRISPR , co prowadzi do rozwoju szerokiej gamy reporterów fluorescencyjnych.

Znakowanie fluorescencyjne wykorzystuje gen kodujący białko fluorescencyjne, który jest wstawiany do ramki kodującej białko, które ma być znakowane. Cechy tekstury i intensywności można wyodrębnić z obrazów znakowanego białka.

Cząsteczki można również znakować in vitro i wprowadzać do komórki za pomocą elektroforezy . Umożliwia to stosowanie mniejszych i bardziej fotostabilnych fluoroforów , ale wymaga dodatkowych etapów przemywania.

Dzięki inżynieryjnej ekspresji reportera FRET w taki sposób, że fluorofory donorowe i emiterowe znajdują się tylko w bliskiej odległości, gdy cząsteczka sygnalizacyjna w górę jest aktywna lub nieaktywna, stosunek intensywności fluorescencji donora do emitera można wykorzystać jako miarę aktywności sygnalizacyjnej. Na przykład w kluczowych wczesnych pracach z wykorzystaniem reporterów FRET do żywych pojedynczych badań skonstruowano reportery FRET aktywności GTPazy Rho .

Reporterzy translokacji jądrowej wykorzystują zmodyfikowane sygnały importu i eksportu jądrowego , które mogą być hamowane przez cząsteczki sygnałowe, do rejestrowania aktywności sygnalizacyjnej poprzez stosunek reportera jądrowego do reportera cytoplazmatycznego.

Obrazowanie na żywo

Następnie należy przeprowadzić obrazowanie żywych komórek znakowanych fluorescencyjnie komórek. Wymaga to jednoczesnej inkubacji komórek w warunkach wolnych od stresu podczas wykonywania obrazowania. Istnieje kilka czynników, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze warunków obrazowania, takich jak fototoksyczność, fotowybielanie , łatwość śledzenia, szybkość zmian aktywności sygnalizacyjnej oraz stosunek sygnału do szumu. Wszystko to dotyczy częstotliwości obrazowania i natężenia oświetlenia.

Fototoksyczność może wynikać z narażenia na duże ilości światła przez długi czas. Komórki staną się zestresowane, co może prowadzić do apoptozy. Obrazowanie o wysokiej częstotliwości i intensywności może spowodować zmniejszenie sygnału fluoroforu w wyniku fotowybielania. Obrazowanie o wyższej częstotliwości generalnie ułatwia automatyczne śledzenie komórek. Częstotliwości obrazowania powinny być w stanie uchwycić niezbędne zmiany aktywności sygnalizacyjnej. Obrazowanie o niskiej intensywności lub słabe reportery mogą uniemożliwić wykrycie niskiego poziomu aktywności sygnalizacyjnej w komórce.

Śledzenie żywych komórek

Po obrazowaniu żywych komórek wykorzystywane jest zautomatyzowane oprogramowanie śledzące w celu wyodrębnienia danych szeregów czasowych z filmów przedstawiających komórki. Śledzenie żywych komórek jest generalnie podzielone na dwa etapy, segmentację obrazu komórek lub ich jąder oraz śledzenie komórek/jąder na podstawie tych segmentów. Na tym etapie badania obrazowania żywych pojedynczych komórek nadal istnieje wiele wyzwań. Jednak ostatnie postępy zostały podkreślone w dziedzinie pierwszego obiektywnego porównania technik śledzenia pojedynczych komórek.

Ilościowe obrazowanie fazowe (QPI) jest szczególnie przydatne do śledzenia żywych komórek. Ponieważ QPI nie zawiera znaczników, nie wywołuje fototoksyczności ani fotowybielania związanego z obrazowaniem fluorescencyjnym. QPI oferuje znacznie wyższy kontrast niż konwencjonalne techniki obrazowania fazowego, takie jak mikroskopia z kontrastem fazowym . Wyższy kontrast ułatwia bardziej niezawodną segmentację i śledzenie komórek niż jest to możliwe w przypadku konwencjonalnego obrazowania fazowego.

Coraz szerzej stosowane są również nowe techniki, które wykorzystują kombinację tradycyjnych technik segmentacji obrazu i głębokiego uczenia się do segmentacji komórek.

Analiza danych

W końcowej fazie badania obrazowania pojedynczych komórek na żywo przeprowadzane jest modelowanie i analiza danych szeregów czasowych wyodrębnionych ze śledzonych komórek. Profile drzew rodowych można skonstruować w celu ujawnienia heterogeniczności w odpowiedzi poszczególnych komórek i sygnalizacji w dół. duże nakładanie się analizy żywych danych z pojedynczych komórek i modelowania systemów biologicznych przy użyciu zwykłych równań różniczkowych . Wyniki tego kluczowego etapu analizy danych będą motorem dalszych eksperymentów, na przykład poprzez zakłócanie aspektów badanego systemu, a następnie porównywanie dynamiki sygnalizacji z dynamiką populacji kontrolnej.

Aplikacje

Analizując dynamikę sygnalizacji pojedynczych komórek w całych populacjach, badania pojedynczych żywych komórek pozwalają nam teraz zrozumieć, w jaki sposób ta dynamika wpływa na kluczowe komórkowe procesy decyzyjne. Na przykład badania na żywych pojedynczych komórkach czynnika wzrostu ERK wykazały, że posiada on cyfrową aktywację „wszystko albo nic”. Co więcej, ta aktywacja „wszystko albo nic” była pulsacyjna, a częstotliwość impulsów z kolei decydowała o tym, czy komórki ssaków zobowiążą się do wejścia w cykl komórkowy, czy nie. W innym kluczowym przykładzie, żywe badania pojedynczych komórek CDK2 aktywność w komórkach ssaków wykazała, że ​​bifurkacja aktywności CDK2 po mitozie określała, czy komórki będą się dalej proliferować, czy też wejdą w stan spoczynku; teraz wykazano, przy użyciu metod żywych pojedynczych komórek, że jest spowodowane przez stochastyczne uszkodzenie DNA indukujące regulację w górę p21 , co hamuje aktywność CDK2. Idąc dalej, badania na żywych pojedynczych komórkach będą teraz prawdopodobnie nie współpracować z wieloma reporterami w pojedyncze linie komórkowe, aby umożliwić zrozumienie złożonych procesów decyzyjnych, jednak nadal istnieją wyzwania w zwiększaniu skali badań na żywych pojedynczych komórkach.