Przeglądanie treści

Badania przesiewowe o wysokiej zawartości (HCS), znane również jako analiza o wysokiej zawartości (HCA) lub celomika , to metoda stosowana w badaniach biologicznych i odkrywaniu leków w celu identyfikacji substancji, takich jak małe cząsteczki , peptydy lub RNAi , które zmieniają fenotyp komórkę w pożądany sposób . Dlatego badanie przesiewowe o wysokiej zawartości jest rodzajem badania fenotypowego przeprowadzane w komórkach polegające na analizie całych komórek lub składników komórek z jednoczesnym odczytem kilku parametrów. HCS jest powiązany z wysokowydajnymi badaniami przesiewowymi (HTS), w których tysiące związków testuje się równolegle pod kątem ich aktywności w jednym lub kilku testach biologicznych, ale obejmuje testy bardziej złożonych fenotypów komórkowych jako wyniki. Zmiany fenotypowe mogą obejmować wzrost lub spadek produkcji produktów komórkowych, takich jak białka i/lub zmiany w morfologii (wygląd) komórki. Dlatego HCA zazwyczaj obejmuje zautomatyzowaną mikroskopię i analizę obrazu. W przeciwieństwie do analizy o dużej zawartości, badanie przesiewowe o dużej zawartości implikuje pewien poziom przepustowości, dlatego termin „przeszukiwanie” odróżnia HCS od HCA, które mogą zawierać dużo treści, ale mają niską przepustowość.

W badaniach przesiewowych o dużej zawartości komórki są najpierw inkubowane z substancją, a po pewnym czasie analizowane są struktury i składniki molekularne komórek. Najczęściej stosowana analiza polega na znakowaniu białek znacznikami fluorescencyjnymi , a ostatecznie zmiany fenotypu komórki są mierzone za pomocą automatycznej analizy obrazu . Dzięki zastosowaniu znaczników fluorescencyjnych o różnych maksimach absorpcji i emisji, możliwy jest równoległy pomiar kilku różnych składników komórki. Ponadto obrazowanie jest w stanie wykryć zmiany na poziomie subkomórkowym ( np . jądro a inne organelle ). W związku z tym można zebrać dużą liczbę punktów danych na komórkę. Oprócz znakowania fluorescencyjnego w badaniach przesiewowych o dużej zawartości stosowano różne testy bez znaczników.

Ogólne zasady

Jednym z zastosowań HCS jest odkrywanie nowych kandydatów na leki

Badania przesiewowe o wysokiej zawartości (HCS) w systemach opartych na komórkach wykorzystują żywe komórki jako narzędzia w badaniach biologicznych w celu wyjaśnienia działania normalnych i chorych komórek. HCS jest również używany do odkrywania i optymalizowania nowych kandydatów na leki. Badania przesiewowe o wysokiej zawartości to połączenie nowoczesnej biologii komórki , ze wszystkimi jej narzędziami molekularnymi, ze zautomatyzowaną mikroskopią o wysokiej rozdzielczości i obsługą robotów. Komórki są najpierw wystawiane na działanie chemikaliów lub RNAi . Następnie wykrywa się zmiany w morfologii komórek za pomocą analizy obrazu . Zmiany ilości białek syntetyzowanych przez komórki są mierzone przy użyciu różnych technik, takich jak zielone białka fluorescencyjne połączone z białkami endogennymi lub przeciwciała fluorescencyjne .

Technologię można wykorzystać do określenia, czy potencjalny lek modyfikuje przebieg choroby. Na przykład u ludzi receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) to duża rodzina około 880 białek powierzchniowych komórek, które przekształcają zmiany zewnątrzkomórkowe w środowisku w odpowiedź komórkową, np. hormon regulujący do krwioobiegu. Aktywacja tych GPCR może obejmować ich wejście do komórek, a kiedy można to zwizualizować, może to stanowić podstawę systematycznej analizy funkcji receptora poprzez genetykę chemiczną , systematyczny genom szeroko zakrojone badania przesiewowe lub manipulacje fizjologiczne.

Na poziomie komórkowym główną zaletą tej metody w porównaniu z szybszym, ale mniej szczegółowym, wysokowydajnym skriningiem jest równoległa akwizycja danych na temat różnych właściwości komórek, np. aktywności kaskad transdukcji sygnału i integralności cytoszkieletu . Chociaż HCS jest wolniejszy, bogactwo uzyskanych danych pozwala na głębsze zrozumienie działania leków.

Zautomatyzowane badania przesiewowe oparte na obrazach pozwalają na identyfikację małych związków zmieniających fenotypy komórkowe i są przydatne przy odkrywaniu nowych farmaceutyków i nowych biologicznych narzędzi do modyfikowania funkcji komórek. Wybór cząsteczek w oparciu o fenotyp komórkowy nie wymaga wcześniejszej znajomości celów biochemicznych, na które wpływają związki. Jednak identyfikacja celu biologicznego znacznie ułatwi późniejszą optymalizację przedkliniczną i rozwój kliniczny związku. Biorąc pod uwagę wzrost wykorzystania fenotypowych/wizualnych badań przesiewowych jako narzędzi biologicznych komórki, wymagane są metody umożliwiające systematyczną biochemiczną identyfikację celu, jeśli cząsteczki te mają być szeroko stosowane. Identyfikacja celu została zdefiniowana jako krok ograniczający szybkość w genetyce chemicznej/przeszukiwaniu dużej zawartości.

Oprzyrządowanie

Automatyczny czytnik obrazów konfokalnych

Technologia wysokowydajnych badań przesiewowych opiera się głównie na zautomatyzowanej mikroskopii cyfrowej i cytometrii przepływowej w połączeniu z systemami informatycznymi do analizy i przechowywania danych. „High-content” lub technologia biologii wizualnej ma dwa cele, po pierwsze, aby uzyskać przestrzennie lub czasowo rozdzielone informacje o zdarzeniu, a po drugie, aby automatycznie je określić ilościowo. Instrumenty o rozdzielczości przestrzennej to zazwyczaj zautomatyzowane mikroskopy , a rozdzielczość czasowa nadal wymaga w większości przypadków jakiejś formy pomiaru fluorescencji. Oznacza to, że wiele instrumentów HCS jest ( fluorescencyjnych ) mikroskopy, które są podłączone do jakiejś formy pakietu do analizy obrazu. Zajmują się one wszystkimi etapami wykonywania zdjęć fluorescencyjnych komórek i zapewniają szybką, zautomatyzowaną i bezstronną ocenę eksperymentów.

Instrumenty HCS dostępne obecnie na rynku można podzielić na podstawie szeregu specyfikacji, które znacząco wpływają na wszechstronność instrumentów i całkowity koszt. Obejmują one prędkość, komorę żywych komórek, która obejmuje kontrolę temperatury i CO2 ₍ niektóre mają również kontrolę wilgotności do długoterminowego obrazowania żywych komórek), wbudowany pipetor lub iniektor do szybkich testów kinetycznych oraz dodatkowe tryby obrazowania, takie jak konfokalny, jasne pole , kontrast fazowy i FRET. Jedną z najbardziej rzucających się w oczy różnic jest to, czy instrumenty są optyczne konfokalne , czy nie. Mikroskopia konfokalna podsumowuje jako obrazowanie/rozdzielanie cienkiego wycinka przez obiekt i odrzucanie nieostrego światła, które pochodzi spoza tego wycinka. Obrazowanie konfokalne umożliwia obraz o wyższym stosunku sygnału do szumu i wyższej rozdzielczości niż częściej stosowana mikroskopia epifluorescencyjna . W zależności od instrumentu konfokalność uzyskuje się za pomocą skanowania laserowego, pojedynczego wirującego dysku z otworami lub szczelinami, podwójnego wirującego dysku lub wirtualnej szczeliny. Istnieją kompromisy w zakresie czułości, rozdzielczości, szybkości, fototoksyczności, fotowybielania, złożoności instrumentu i ceny między tymi różnymi technikami konfokalnymi.

To, co łączy wszystkie instrumenty, to możliwość automatycznego wykonywania, przechowywania i interpretowania obrazów oraz integracji z dużymi zrobotyzowanymi celami/platformami obsługującymi nośniki.

Oprogramowanie

Wiele ekranów jest analizowanych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, które jest dołączone do instrumentu, zapewniając rozwiązanie „pod klucz”. Alternatywne oprogramowanie innych firm jest często używane w przypadku szczególnie wymagających ekranów lub gdy laboratorium lub placówka ma wiele przyrządów i chce ujednolicić je w ramach jednej platformy analitycznej. Niektóre oprogramowanie przyrządu umożliwia masowe importowanie i eksportowanie obrazów i danych użytkownikom, którzy chcą przeprowadzić taką standaryzację na jednej platformie analitycznej bez korzystania z oprogramowania innych firm.

Aplikacje

Technologia ta pozwala na przeprowadzenie (bardzo) dużej liczby eksperymentów, umożliwiając badania przesiewowe. Systemy komórkowe są wykorzystywane głównie w genetyce chemicznej, gdzie duże, różnorodne kolekcje małych cząsteczek są systematycznie testowane pod kątem ich wpływu na systemy modeli komórkowych. Nowe leki można znaleźć za pomocą ekranów dziesiątek tysięcy cząsteczek, a te są obiecujące dla przyszłości opracowywania leków. Oprócz odkrywania leków, genetyka chemiczna ma na celu funkcjonalizację genomu poprzez identyfikację małych cząsteczek, które działają na większość z 21 000 produktów genów w komórce. Częścią tych wysiłków będzie zaawansowana technologia, która może dostarczyć użytecznych narzędzi do uczenia się, gdzie i kiedy działają białka, wybijając je chemicznie. Byłoby to najbardziej przydatne w przypadku genu, w przypadku którego nie można wytworzyć myszy z nokautem (brak jednego lub kilku genów), ponieważ białko jest wymagane do rozwoju, wzrostu lub w inny sposób śmiercionośne, gdy go nie ma. Nokaut chemiczny może dotyczyć tego, jak i gdzie działają te geny. Ponadto technologia jest stosowana w połączeniu z RNAi do identyfikacji zestawów genów zaangażowanych w określone mechanizmy, na przykład podział komórki. W tym przypadku biblioteki RNA, obejmujące cały zestaw przewidywanych genów w genomie docelowego organizmu, można wykorzystać do identyfikacji odpowiednich podzbiorów, ułatwiając adnotację genów, dla których wcześniej nie ustalono jasnej roli. Duże zbiory danych generowane przez zautomatyzowaną biologię komórki zawierają przestrzennie rozdzielone dane ilościowe, które można wykorzystać do budowania modeli na poziomie systemów i symulacji funkcjonowania komórek i organizmów. Modele funkcji komórek biologii systemowej umożliwiłyby przewidywanie, dlaczego, gdzie i jak komórka reaguje na zmiany zewnętrzne, wzrost i choroby.

Historia

Technologia przesiewowa o wysokiej zawartości umożliwia ocenę wielu parametrów biochemicznych i morfologicznych w nienaruszonych układach biologicznych.

W przypadku podejść opartych na komórkach użyteczność zautomatyzowanej biologii komórkowej wymaga zbadania, w jaki sposób automatyzacja i obiektywne pomiary mogą poprawić eksperymentowanie i zrozumienie choroby. Po pierwsze, usuwa wpływ badacza na większość, ale nie wszystkie, aspektów badań nad biologią komórki, a po drugie umożliwia całkowicie nowe podejście.

Podsumowując, klasyczna XX-wieczna biologia komórkowa wykorzystywała linie komórkowe hodowane w hodowlach, w których eksperymenty mierzono przy użyciu bardzo podobnych do opisanych tutaj, ale tam badacz dokonywał wyboru, co i jak mierzono. Na początku lat 90. rozwój CCD ( aparatów ze sprzężeniem ładunkowym ) do celów badawczych stworzył możliwość mierzenia cech na zdjęciach komórek, takich jak ilość białka w jądrze, a ile na zewnątrz. Wkrótce pojawiły się zaawansowane pomiary przy użyciu nowych cząsteczek fluorescencyjnych, które są wykorzystywane do pomiaru właściwości komórek, takich jak drugi przekaźnik stężeń lub pH wewnętrznych kompartmentów komórkowych. Szerokie zastosowanie zielonego białka fluorescencyjnego, naturalnej cząsteczki białka fluorescencyjnego z meduz, przyspieszyło następnie trend w kierunku obrazowania komórek jako głównego nurtu technologii w biologii komórki. Pomimo tych postępów, wybór komórki do zobrazowania i danych do przedstawienia oraz sposobu ich analizy nadal należał do badacza.

Analogicznie, jeśli ktoś wyobrazi sobie boisko do piłki nożnej i leżące na nim talerze obiadowe, zamiast patrzeć na nie wszystkie, badacz wybrałby garść w pobliżu linii podziału i musiałby zostawić resztę. W tej analogii pole to szalka do hodowli tkankowej, płytki z rosnącymi na niej komórkami. O ile było to rozsądne i pragmatyczne podejście, automatyzacja całego procesu i analiza umożliwia analizę całej populacji żywych komórek, dzięki czemu można zmierzyć całe boisko piłkarskie.

Zobacz też

Dalsza lektura

Abraham VC, Taylor DL, Haskins JR (styczeń 2004). „Wysokiej jakości badanie przesiewowe zastosowane w biologii komórki na dużą skalę”. Trendy Biotechnologia . 22 (1): 15–22. doi : 10.1016/j.tibtech.2003.10.012 . PMID 14690618 .
Bleicher KH, Böhm HJ, Müller K, Alanine AI (maj 2003). „Generowanie trafień i leadów: poza wysokowydajnym badaniem przesiewowym”. Nat Rev Drug Discov . 2 (5): 369–78. doi : 10.1038/nrd1086 . PMID 12750740 . S2CID 4859609 .
Burdine L, Kodadek T (maj 2004). „Identyfikacja celu w genetyce chemicznej: (często) brakujące ogniwo” . chemia Biol . 11 (5): 593-7. doi : 10.1016/j.chembiol.2004.05.001 . PMID 15157870 .
Carpenter AE, Sabatini DM (styczeń 2004). „Systematyczne ekrany funkcji genów obejmujące cały genom”. Nat. ksiądz Genet . 5 (1): 11–22. doi : 10.1038/nrg1248 . PMID 14708012 . S2CID 637682 .
Omta WA (styczeń 2020). Odkrywanie wiedzy w badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości (praca dyplomowa). Uniwersytet w Utrechcie. doi : 10.33540/198 . ISBN 978-90-393-7283-8 .
Edwards BS, Oprea T, Prossnitz ER, Sklar LA (sierpień 2004). „Cytometria przepływowa do wysokowydajnych badań przesiewowych o dużej zawartości”. Curr Opin Chem Biol . 8 (4): 392–8. doi : 10.1016/j.cbpa.2004.06.007 . PMID 15288249 .
Xu GW, Mawji IA, Macrae CJ, Koch CA, Datti A, Wrana JL, Dennis JW, Schimmer AD (marzec 2008). „Wysokozawarty ekran chemiczny identyfikuje eliptykę jako modulator lokalizacji jądrowej p53”. apoptoza . 13 (3): 413–22. doi : 10.1007/s10495-007-0175-4 . PMID 18181020 . S2CID 8321422 .
Giuliano KA, Haskins JR, Taylor DL (sierpień 2003). „Postępy w badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości pod kątem odkrywania leków”. Test Drug Dev Technol . 1 (4): 565–77. doi : 10.1089/154065803322302826 . PMID 15090253 .
Liszewski, Kathy (2014). „Analiza wysokiej zawartości: rozwiązanie„ w sam raz ”” . gen. inż. Biotechnologia. Aktualności . 34 (3).
Milligan G (lipiec 2003). „Wysokozawarte testy do regulacji ligandów receptorów sprzężonych z białkiem G”. Odkrycie leku dzisiaj . 8 (13): 579–85. doi : 10.1016/S1359-6446(03)02738-7 . PMID 12850333 .
Battich N, Stoeger T, Pelkmans L (październik 2013). „Transkryptomika oparta na obrazie w tysiącach pojedynczych komórek ludzkich w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki”. Metody natury . 10 (11): 1127–1133. doi : 10.1038/nmeth.2657 . PMID 24097269 . S2CID 17472560 .

Linki zewnętrzne