Ograniczenie oligomeru

Restrykcja oligomerowa (w skrócie OR ) to procedura wykrywania zmienionej sekwencji DNA w genomie . Znakowana sonda oligonukleotydowa jest hybrydyzowana z docelowym DNA, a następnie traktowana enzymem restrykcyjnym . Jeśli sonda dokładnie pasuje do celu, enzym restrykcyjny rozszczepi sondę, zmieniając jej rozmiar. Jeśli jednak docelowy DNA nie pasuje dokładnie do sondy, enzym restrykcyjny nie będzie miał wpływu na długość sondy. Technika OR, obecnie rzadko wykonywana, była ściśle związana z rozwojem popularnej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Mechanizm restrykcji oligomerowej.

Przykład

W części 1a schematu sonda oligonukleotydowa, oznaczona na jej lewym końcu (gwiazdka), jest pokazana w górnym wierszu. Jest w pełni komplementarny do swojego docelowego DNA (tutaj pobranego z ludzkiego genu β-hemoglobiny ), jak pokazano w następnym wierszu. Część sondy zawiera miejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego Dde I (podkreślone).

W części 1b enzym restrykcyjny rozszczepił sondę i jej cel (Dde I pozostawia trzy niesparowane zasady na każdym końcu). Oznakowany koniec sondy ma teraz długość zaledwie 8 zasad i można go łatwo oddzielić za pomocą elektroforezy żelowej od nieprzyciętej sondy, która miała długość 40 zasad.

W części 2 ta sama sonda jest pokazana zhybrydyzowana z docelowym DNA, które zawiera pojedynczą mutację zasady (tutaj mutację odpowiedzialną za anemię sierpowatokrwinkową lub SCA). Niedopasowana hybryda nie działa już jako miejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego, a sonda pozostaje na swojej pierwotnej długości.

Historia

Technika restrykcji oligomeru została opracowana jako odmiana metody oznaczania polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), z nadzieją na uniknięcie pracochłonnego etapu Southern blotting stosowanego w analizie RFLP. OR został wymyślony przez Randalla Saiki i Henry'ego Erlicha na początku lat 80., pracujących w Cetus Corporation w Emeryville w Kalifornii . Został opatentowany w 1984 i opublikowany w 1985, po zastosowaniu mutacji genomowej odpowiedzialnej za anemię sierpowatokrwinkową . OR został wkrótce zastąpiony przez bardziej ogólną technikę oligonukleotydowe specyficzne dla alleli (ASO).

Problemy

Metoda ograniczeń oligomerowych była nękana przez szereg problemów:

• Można go zastosować tylko do małego zestawu polimorfizmów DNA, które zmieniają miejsce restrykcyjne, i tylko do tych miejsc, dla których znana jest informacja o sekwencji. Wiele znanych testów RFLP wykryło polimorfizmy, które były daleko od lokalizacji ich sond.
• Trudno jest oznaczyć oligonukleotydy do poziomu wystarczająco wysokiego, aby użyć ich jako sond do genomowego DNA. Ten problem nękał również rozwój sond ASO.
• Trudno jest zaprojektować oligonukleotydy i użyć ich w taki sposób, aby stały się sondami hybrydyzacyjnymi tylko dla jednego miejsca w genomie. Wiązanie z nieswoistymi lokalizacjami może często przesłaniać wpływ sondy na lokalizację docelową.
• Nie wszystkie enzymy restrykcyjne mają pożądaną specyficzność dla ich rozpoznawanej sekwencji. Niektóre potrafią rozpoznawać i ciąć jednoniciowy DNA, a niektóre wykazują niski poziom rozszczepiania niedopasowanych miejsc. Nawet niewielka ilość niespecyficznego rozszczepienia może zalać słaby sygnał oczekiwany od sekwencji docelowej.
• Trudno było zaprojektować metodę OR, która obejmowałaby kontrole dla obu testowanych alleli. W części 2 uproszczonego przykładu opisanego powyżej, sonda nie była cięta podczas hybrydyzacji ze zmutowanym celem. Ale ten sam (nie-) wynik wystąpiłby w przypadku dużego nadmiaru niezhybrydyzowanej sondy, jak również w przypadku wystąpienia jakiegokolwiek problemu uniemożliwiającego całkowite trawienie przez enzym restrykcyjny. W faktycznie opisanej metodzie drugie niepolimorficzne miejsce restrykcyjne zostało użyte do przecięcia całej zhybrydyzowanej sondy, a drugi nieznakowany oligonukleotyd został użyty do „zablokowania” niezhybrydyzowanej sondy. Kontrole te nie byłyby dostępne dla innych celów.

Związek z PCR

Pomimo swoich ograniczeń, technika OR skorzystała z jej ścisłego związku z rozwojem reakcji łańcuchowej polimerazy. Kary Mullis , który również pracował w Cetus, zsyntetyzował sondy oligonukleotydowe testowane przez Saiki i Erlicha. Świadom problemów, z jakimi się borykali, przewidział alternatywną metodę analizy mutacji SCA, która wykorzystywałaby elementy techniki sekwencjonowania DNA Sangera . Zdając sobie sprawę z trudności hybrydyzacji startera oligonukleotydowego z pojedynczym miejscem w genomie, rozważał użycie drugiego startera na przeciwległej nici. Następnie uogólnił ten proces i zdał sobie sprawę, że wielokrotne przedłużanie dwóch starterów prowadziłoby do wykładniczego wzrostu segmentu DNA między starterami - reakcja łańcuchowa replikacji katalizowana przez polimerazę DNA .

Ponieważ Mullis napotkał własne trudności w demonstrowaniu PCR , dołączył do istniejącej grupy badaczy, którzy zajmowali się problemami z OR. Wspólnie opracowali połączony test PCR-OR. W ten sposób OR stała się pierwszą metodą stosowaną do analizy genomowego DNA amplifikowanego metodą PCR.

Mullis napotkał również trudności w opublikowaniu podstawowej idei PCR (czasopisma naukowe rzadko publikują koncepcje bez towarzyszących im wyników). Kiedy jego rękopis dla czasopisma Nature został odrzucony, podstawowy opis PCR został w pośpiechu dodany do artykułu, który pierwotnie miał przedstawiać metodę OR (Mullis był tam również współautorem). W ten sposób ten artykuł OR stał się pierwszą publikacją dotyczącą PCR i przez kilka lat stał się raportem najczęściej cytowanym przez innych badaczy.