Plama Leishmana

Barwienie Leishmana przedstawiające stadium schizonta pasożyta malarii Plasmodium vivax

Plama Leishmana , znana również jako plama Leishmana , jest stosowana w mikroskopii do barwienia rozmazów krwi . Zwykle jest używany do rozróżniania i identyfikacji białych krwinek , pasożytów malarii i trypanosomów . Opiera się na metanolowej mieszaninie „polichromowanego” błękitu metylenowego (tj. odmetylowanego do różnych lazurów) i eozyny . Metanolowy roztwór podstawowy jest stabilny i służy również do bezpośredniego utrwalenia rozmazu, eliminując etap wstępnego utrwalania. Jeśli roztwór roboczy jest sporządzony przez rozcieńczenie buforem wodnym, otrzymana mieszanina jest bardzo niestabilna i nie może być używana przez długi czas. Plamka Leishman została nazwana na cześć jej wynalazcy, The Szkocki patolog William Boog Leishman . Jest to wersja plamy Romanowsky'ego , a zatem jest podobna do plamy Giemsy , plamy Jennera i plamy Wrighta i może być częściowo zastąpiona przez te plamy .

Przygotowanie i przechowywanie

Wiele firm sprzedaje Leishman Stain w postaci suchego proszku, który jest następnie rekonstytuowany metanolem . Ciepło i jasne światło utleniają plamę i powodują wytrącanie się nierozpuszczalnych osadów, takich jak fiolet metylenowy (Bernthsen) lub sole lazurowo-eozynianowe.

Zalety i wady

Zalety

Według podręcznika Sir Johna Viviana Dacie , Practical Hematology , „Wśród obecnie używanych barwników Romanowskiego, barwnik Jennera jest najprostszy, a barwnik Giemsy najbardziej złożony. Barwnik Leishmana, który zajmuje pozycję pośrednią, jest nadal szeroko stosowany w rutynowym barwieniu”.

Protokół WHO wymienia:

Istnieje wiele różnych kombinacji tych barwników, które różnią się właściwościami barwienia. Maj-Grunwald-Giemsa to dobra metoda do rutynowych prac. Barwienie Wrighta jest prostszą metodą, podczas gdy metoda Leishmana jest również prostą metodą, która jest szczególnie odpowiednia, gdy barwienie rozmazu krwi jest pilnie potrzebne lub rutynowe barwienie nie jest dostępne (np. w nocy). Barwienie Fielda to szybkie barwienie stosowane głównie na cienkich warstwach pasożytów malarii. Niezależnie od zastosowanej metody, ważne jest, aby wybrać barwniki, które nie są zanieczyszczone innymi barwnikami lub solami metali.

Sir William Boog Leishman z Londynu i Karl Reuter z Niemiec niezależnie odkryli w 1901 roku to, co uważa się za „Być może najbardziej praktyczną modyfikację bejcy Małachowskiego”. Przyjęli najlepsze aspekty plam opracowanych przez Małachowskiego i Jennera, tj. użyli polichromowanego błękitu metylenowego (przypadkowo wykonane przez Romanowsky'ego, który otrzymał tę nazwę, systematycznie wykonywane przez Ernsta Malachowskiego jeszcze przed Romanowsky'm i ponownie odkryte przez Bernharda Nochta, ale nieznane Jennerowi, Mayowi, Grunwaldowi i wielu innym, którzy używali prostego błękitu metylenowego) i filtrowanie osadu lazurowego eozynianu z wodną mieszaninę i ponowne rozpuszczenie w rozpuszczalniku alkoholowym (mądrość Jennera). Różnice między metodami Leishmana i Reutera były następujące: Leishman użył metanolu (podobnie jak Jenner) i zastąpił Eozynę B Eozyną Y, podczas gdy Reuter użył alkoholu etylowego i słusznie podkreślił znaczenie użycia absolutnie czystego rozpuszczalnika. Obie metody dały trwałe plamy i pożądany fioletowy kolor.

Dobry kontrast

Barwnik Leishmana generalnie wykazuje jaskrawofioletowy kolor jądra i granulek neutrofilów, dla których zliczanie różnicowe jest wygodne i sprawia, że ​​jakość barwienia jest lepsza niż barwniki na bazie prostego błękitu metylenowego i eozyny, które nie dają wystarczającego kontrastu między cytoplazmą a jądro. Ponieważ Leishman, podobnie jak inne barwniki Romanowsky'ego, lepiej barwi szczegóły cytoplazmy i ziarnistości, hematolodzy na ogół je preferują (jednakże patrz poniżej na temat cytologów). W porównaniu z kosztownymi i toksycznymi czystymi syntetycznymi odczynnikami opartymi na AZure B i eozynie Y, stosowanymi w metodach referencyjnych ICSH, które również nie są wolne od wad polegających na utlenieniu i ostatecznie nadaniu szarego odcienia zamiast optymalnych dla cytoplazmy niebieskich kolorów, Leishman jest tanim łatwo dostępna i łatwa do wykonania technika dająca dość akceptowalny kontrast.

Dobra czułość na pasożyta malarii

Udokumentowano, że barwienie Leishmana jest bardziej czułe niż barwienie Fielda i równie dobre jak barwienie fluorescencyjne w wykrywaniu pasożyta malarii.

Niedogodności

Trudność w kontrolowaniu stosunku molowego

Skład polichromowanego błękitu metylenowego zmieszanego z eozyną nigdy nie jest tak dobry jak bezpośrednio odważone i zmieszane proporcje w bejcach typu Giemsa. Albert Plehn w 1890 roku doszedł do wniosku, że stosunek molowy barwników zasadowych do kwaśnych należy zwiększyć z 2:1 do 3:1, jednak od czasów Jennersa (1899) zastosowanie kryształów błękitnego eozynianu przywróciło ten stosunek do niezadowalającego 2:1, a głębia koloru stała się mniejsza. Dopiero praca Gustava Giemsy i im podobnych, którzy ponownie ręcznie kontrolowali proporcje tych dwóch składników, przywróciła głębię barwienia. Jednak Giemsa i inni, którzy sztucznie kontrolowali proporcje, czasami popadali w drugą skrajność (duży nadmiar molowy lazuru do stosunku 16,1), co prawdopodobnie było niepotrzebne. na ICSH optymalny stosunek wynosi od 6,5 do 7,3.

Niestabilność

Barwnik Leishmana po rekonstytucji buforem staje się bardzo niestabilny (w przeciwieństwie do barwnika Giemsa, który jest stosunkowo bardziej stabilny dzięki glicerynie lub barwników referencyjnych ICSH, które wykorzystują metanol + DMSO w stosunku 6:4 v/v) i zaczyna wytrącać się i wymaga wielokrotnego filtrowania . Bez uważnego nadzoru wchłanianie wody, odparowywanie metanolu z otwartego pojemnika i wielokrotne filtrowanie zmienia skład i wymaga częstych zmian, czyniąc tę ​​metodę marnotrawną. Jeśli nie zostanie przefiltrowany, osad osadzony na rozmazie może zostać pomylony z płytkami krwi. Ważne jest, aby nie wstrząsać butelką z barwnikiem przed użyciem, w przeciwnym razie wytrącony osad zostanie ponownie zawieszony i osadza się na filmach podczas barwienia, powodując liczne artefakty i bardzo utrudniając mikroskopię.

Kontrast cytoplazmatyczny dobry, ale kontrast jądrowy nie tak dobry jak H&E

Podobnie jak wszystkie inne metody Małachowskiego-Romanowskiego-Giemsy, zanika ona z czasem i nie może być stabilnie archiwizowana przez długi czas. Również jego powyższe odpowiedniki barwią jądra na ciemnofioletowo, a szczegóły cech jądrowych nie są tak wyraźne jak hematoksylen i eozyna , które są preferowane przez niektórych cytopatologów. Ale w ten sposób jest to metoda uzupełniająca (ponieważ lepiej wybarwia granulki szczegółów cytoplazmatycznych itp. niż barwienie H&E ).