Szybka amplifikacja końców cDNA
Szybka amplifikacja końców cDNA ( RACE ) to technika stosowana w biologii molekularnej w celu uzyskania pełnej długości sekwencji transkryptu RNA występującego w komórce. Wynikiem RACE jest wytworzenie cDNA interesującej sekwencji RNA, wytworzonej poprzez odwrotną transkrypcję , po której następuje amplifikacja PCR kopii cDNA (patrz RT-PCR ). Amplifikowane kopie cDNA są następnie sekwencjonowane i, jeśli są wystarczająco długie, powinny zostać zmapowane do unikalnego regionu genomowego. Po RACE często następuje klonowanie przed sekwencjonowaniem pierwotnie pojedynczych cząsteczek RNA. Bardziej wydajną alternatywą, przydatną do identyfikacji nowych struktur transkryptów, jest sekwencjonowanie produktów RACE za pomocą technologii sekwencjonowania nowej generacji.
Proces
RACE może dostarczyć sekwencję transkryptu RNA z małej znanej sekwencji w obrębie transkryptu do końca 5' (5' RACE-PCR) lub końca 3' (3' RACE-PCR) RNA. Technika ta jest czasami nazywana jednostronnym PCR lub zakotwiczonym PCR .
Pierwszym krokiem w RACE jest zastosowanie odwrotnej transkrypcji w celu wytworzenia kopii cDNA regionu transkryptu RNA. W tym procesie nieznana końcowa część transkryptu jest kopiowana przy użyciu znanej sekwencji ze środka transkryptu. Skopiowany region jest ograniczony znaną sekwencją na końcu 5' lub 3'.
Protokoły dla wyścigów 5' i 3' różnią się nieznacznie. 5' RACE-PCR rozpoczyna się od użycia mRNA jako matrycy dla pierwszej rundy reakcji syntezy cDNA (lub odwrotnej transkrypcji ) przy użyciu antysensownego (odwrotnego) startera oligonukleotydowego , który rozpoznaje znaną sekwencję w środku genu będącego przedmiotem zainteresowania; starter nazywany jest starterem specyficznym dla genu (GPS). Starter wiąże się z mRNA, a enzym odwrotna transkryptaza dodaje pary zasad do końca 3' startera, aby wytworzyć specyficzny jednoniciowy produkt cDNA; jest to odwrotne uzupełnienie mRNA. Po syntezie cDNA, enzymatyczna terminalna transferaza deoksynukleotydylowa (TdT) jest używana do dodania ciągu identycznych nukleotydów , znany jako ogon homopolimerowy, do końca 3' cDNA. (Istnieje kilka innych sposobów dodania sekwencji 3'-końcowej do pierwszej nici syntezy cDNA de novo, które są znacznie bardziej wydajne niż ogon homopolimerowy, ale sens metody pozostaje taki sam). reakcję PCR , w której wykorzystuje się drugi starter specyficzny dla genu antysensownego (GSP2), który wiąże się ze znaną sekwencją, oraz starter uniwersalny sensowny (w przód) (UP), który wiąże ogon homopolimerowy dodany do końców 3' cDNA w celu amplifikacji produktu cDNA od końca 5'.
3' RACE-PCR wykorzystuje naturalny ogon poliA , który istnieje na końcu 3' wszystkich eukariotycznych mRNA do starterów podczas odwrotnej transkrypcji, więc ta metoda nie wymaga dodawania nukleotydów przez TdT. cDNA wytwarza się przy użyciu startera adaptorowego oligo-dT (startera z krótką sekwencją nukleotydów deoksytyminowych), który uzupełnia odcinek poliA i dodaje specjalną sekwencję adaptorową do końca 5' każdego cDNA. Następnie stosuje się PCR do amplifikacji 3' cDNA ze znanego regionu przy użyciu sensownego GSP i antysensownego startera komplementarnego do sekwencji adaptorowej.
Sekwencjonowanie WYŚCIGÓW
Cząsteczki cDNA wytworzone przez RACE można sekwencjonować przy użyciu technologii sekwencjonowania o dużej przepustowości (zwanych także RACE-seq). Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie fragmentów RACE jest wysoce efektywne czasowo, bardziej czułe, mniej kosztowne i technicznie wykonalne w porównaniu z tradycyjną charakteryzacją fragmentów RACE za pomocą klonowania molekularnego , po którym następuje sekwencjonowanie kilku klonów metodą Sangera .
Historia i zastosowania
RACE można zastosować do amplifikacji nieznanych części 5' (5'-RACE) lub 3' (3'-RACE) cząsteczek RNA, gdzie część sekwencji RNA jest znana i jest celem startera specyficznego dla genu. W połączeniu z wysokowydajnym sekwencjonowaniem w celu scharakteryzowania amplifikowanych produktów RACE, możliwe jest zastosowanie tego podejścia do scharakteryzowania dowolnego typu kodujących i niekodujących cząsteczek RNA.
Pomysł połączenia RACE z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem został po raz pierwszy wprowadzony w 2009 roku jako Deep-RACE w celu przeprowadzenia mapowania miejsc startu transkrypcji (TSS) 17 genów w pojedynczej linii komórkowej. Na przykład w badaniu przeprowadzonym w 2014 r. mającym na celu dokładne mapowanie miejsc cięcia docelowego RNA kierowanego przez syntetyczne siRNA , podejście to po raz pierwszy nazwano RACE-seq. Metodologię tę zastosowano ponadto do scharakteryzowania nieznanych części pełnej długości nowych transkryptów i transkryptów fuzyjnych w raku jelita grubego . W innym badaniu mającym na celu scharakteryzowanie nieznanych struktur transkrypcyjnych lncRNA , RACE zastosowano w połączeniu z półdługim sekwencjonowaniem 454 .
- „Szybka amplifikacja końców 5' cDNA” w: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (red. Sambrook, J. & Russell, DW), rozdział 8, protokół 9, 8.54-8.60 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork , USA, 2001)
- Principles of Gene Manipulation and Genomics , SB Primrose i RM Twyman, Blackwell Publishing, 2006 (wyd. 7), strony 111–12.