Represilator

Represilator to genetyczna sieć regulacyjna składająca się z co najmniej jednej pętli sprzężenia zwrotnego z co najmniej trzema genami, z których każdy wyraża białko, które tłumi następny gen w pętli. W badaniach biologicznych represilatory wykorzystano do budowy modeli komórkowych i poznania funkcji komórek. Istnieją zarówno sztuczne, jak i naturalnie występujące represilatory. zbadano naturalnie występujący obwód genu zegara represilatora w systemach Arabidopsis thaliana ( A. thaliana ) i ssakach.

Sztuczne represilatory

Sztuczne represilatory zostały po raz pierwszy zaprojektowane przez Michaela Elowitza i Stanislasa Leiblera w 2000 roku, uzupełniając inne projekty badawcze badające proste układy składników i funkcji komórek. Aby zrozumieć i modelować konstrukcję oraz mechanizmy komórkowe odpowiadające za funkcję komórki, Elowitz i Leibler stworzyli sztuczną sieć składającą się z pętli z trzema represorami transkrypcji . Sieć ta została zaprojektowana od podstaw tak, aby wykazywała stabilne oscylacje, które działają jak system oscylatora elektrycznego o ustalonych okresach czasu. Sieć zaimplementowano w Escherichia coli ( E. coli) poprzez transfer rekombinowanego DNA. Następnie potwierdzono, że zmodyfikowane kolonie rzeczywiście wykazywały pożądane zachowanie oscylacyjne.

Represilator składa się z trzech genów połączonych w pętlę sprzężenia zwrotnego , tak że każdy gen tłumi następny gen w pętli i jest tłumiony przez poprzedni gen. W syntetycznej insercji do E. Coli , jako reporter zastosowano białko zielonej fluorescencji (GFP), tak że zachowanie sieci można było obserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej .

Genetyczna sieć regulacyjna represilatora, w której każde białko podlegające translacji przez gen tłumi kolejne białko w cyklu.

Projekt represilatora opierał się na zasadach biologicznych i obwodów oraz dyskretnych i stochastycznych modelach analizy. Do modelowania kinetyki układu represilatora w oparciu o stężenia białek i mRNA oraz odpowiednie wartości parametrów i współczynnika Hilla wykorzystano sześć równań różniczkowych . W badaniu Elowitz i Leibler wygenerowali dane liczbowe pokazanie oscylacji białek represorowych z wykorzystaniem całkowania i typowych wartości parametrów oraz stochastyczną wersję modelu represilatora z wykorzystaniem podobnych parametrów. Modele te poddano analizie w celu określenia wartości różnych szybkości, które powodowałyby trwałe oscylacje. Stwierdzono, że tym oscylacjom sprzyjały promotory połączone z wydajnymi miejscami wiązania rybosomów , współpracującymi represorami transkrypcji oraz porównywalnymi szybkościami rozpadu białek i mRNA.

Analiza ta uzasadniała dwie cechy konstrukcyjne, które zostały wbudowane w geny. Po pierwsze, regiony promotorowe zastąpiono bardziej wydajnym promotorem hybrydowym, który łączył promotor PL (λ PL) faga lambda E. coli z sekwencjami operatorowymi represora lac ( Lacl ) i represora Tet ( TetR ). Po drugie, aby zmniejszyć rozbieżność między czasem życia białek represorowych i mRNA, znacznik na końcu karboksylowym na podstawie sekwencji ssrA-RNA dodano na końcu 3' każdego genu represora. Znacznik ten jest rozpoznawany przez proteazy, które nakierowują białko na degradację. Projekt zrealizowano przy użyciu plazmidu o małej liczbie kopii kodującego represilator i reportera o większej liczbie kopii, które wykorzystano do transformacji hodowli E. coli .

Naturalnie występujące represilatory

Rośliny

Obwody dobowe u roślin charakteryzują się transkrypcyjną pętlą regulacyjnego sprzężenia zwrotnego zwaną represilatorem. W rdzeniowej pętli oscylatora (zaznaczonej na szaro) u A. thaliana światło jest najpierw wykrywane przez dwa kryptochromy i pięć fitochromów . Dwa czynniki transkrypcyjne, związany z zegarem okołodobowym 1 (CCA1) i późny wydłużony hipokotyl (LHY), tłumią geny związane z ekspresją wieczorną, takie jak czas ekspresji CAB 1 ( TOC1 ) i aktywują geny związane z poranną ekspresją poprzez wiązanie się z ich promotorami. TOC1 , gen wieczorny, pozytywnie reguluje CCA1 i LHY poprzez nieznany mechanizm. Czynnik transkrypcyjny z fazą wieczorną CCA1 Hiking Expedition (CHE) i demetylaza histonowa jumonji C zawierająca domenę 5 (JMJD5) bezpośrednio tłumią CCA1 . Stwierdzono, że inne składniki ulegają ekspresji w ciągu dnia i bezpośrednio lub pośrednio hamują lub aktywują kolejny element w obwodzie dobowym, tworząc w ten sposób złożoną, solidną i elastyczną sieć pętli sprzężenia zwrotnego.

Wyrażenie fazy porannej

Pętla ekspresyjna fazy porannej odnosi się do genów i białek regulujących rytm dnia u A. thaliana . Dwa główne geny to LHY i CCA1, które kodują czynniki transkrypcyjne LHY i CCA1. Białka te tworzą heterodimery , które dostają się do jądra i wiążą się z promotorem genu TOC1 , hamując wytwarzanie białka TOC1. Gdy białko TOC1 ulega ekspresji, służy do regulacji LHY i CCA1 poprzez hamowanie ich transkrypcji. Zostało to później potwierdzone w 2012 roku przez dr Alexandrę Pokhilo, która wykorzystała analizy obliczeniowe, aby wykazać, że TOC1 spełnia tę rolę jako inhibitor LHY i CCA1 . Pętla poranna służy do hamowania hipokotylu , w przeciwieństwie do pętli fazy wieczornej, która sprzyja wydłużaniu hipokotylu. Wykazano, że pętla fazy porannej nie jest w stanie wspierać oscylacji dobowych, gdy geny ekspresji fazy wieczornej zostały zmutowane, co sugeruje współzależność każdego składnika tego naturalnie występującego represilatora.

Wyrażenie fazy wieczornej

Wczesne kwitnienie 3 ( ELF3 ), wczesne kwitnienie 4 ( ELF4 ) i Phytoclock1 ( LUX ) są kluczowymi elementami ekspresji genów zegara fazy wieczornej u A. thaliana. Tworzą kompleks wieczorny, w którym LUX wiąże się z promotorami czynnika oddziałującego z fitochromem 4 ( PIF4 ) i czynnika oddziałującego z fitochromem 5 ( PIF5 ) i je hamuje. W rezultacie wydłużenie hipokotylu jest tłumione wczesnym wieczorem. Kiedy hamowanie zostanie złagodzone późną nocą, hipokotyl wydłuża się. fotoperiodyczne jest kontrolowane przez gen wyjściowy Gigantea ( GI ). GI jest aktywowany w nocy i aktywuje ekspresję stałych ( CO ), co aktywuje ekspresję miejsca kwitnienia T ( FT ). FT powoduje następnie kwitnienie w długich dniach.

Ssaki

Ssaki wyewoluowały endogenny mechanizm synchronizacji, koordynujący zarówno fizjologię, jak i zachowanie w okresie 24-godzinnym. W 2016 roku badacze zidentyfikowali sekwencję trzech kolejnych zahamowań w ramach tego mechanizmu, który uznali za represilator, który obecnie uważa się za główny element tej sieci okołodobowej. Konieczność istnienia tego systemu została ustalona poprzez serię nokautów genów wśród kryptochromu ( Cry ), kropki ( Per ) i Rev-erb -- podstawowe geny zegara ssaków, których nokauty prowadzą do arytmii. Model wygenerowany przez tych badaczy obejmuje Bmal1 jako czynnik napędowy transkrypcji za pośrednictwem E-box, Per2 i Cry1 jako odpowiednio wczesne i późne represory E-box , a także regulator D-box Dbp i receptor jądrowy Rev-erb-α . Sekwencyjne hamowanie przez Rev-erb , Per i Cry1 może generować trwałe oscylacje, a poprzez zaciśnięcie wszystkich innych elementów z wyjątkiem tego represilatora oscylacje utrzymywały się z podobnymi amplitudami i okresami. Wydaje się, że wszystkie sieci oscylacyjne obejmują dowolną kombinację tych trzech podstawowych genów, co wykazano na różnych schematach opublikowanych przez badaczy.

Ostatnia praca

Model represilatora wykorzystano do modelowania i badania innych szlaków i systemów biologicznych. Od tego czasu przeprowadzono szeroko zakrojone prace nad możliwościami modelowania represilatora. W 2003 roku przeprowadzono represilatorową reprezentację i walidację modeli biologicznych, będących modelem o wielu zmiennych, przy użyciu systemu Simpathica, który potwierdził, że model rzeczywiście oscyluje przy całej swojej złożoności.

Jak stwierdzono w oryginalnej pracy Elowitza i Leiblera, ostatecznym celem badań nad represilatorami jest zbudowanie sztucznego zegara dobowego, który odzwierciedla jego naturalny, endogenny odpowiednik. Wiązałoby się to z opracowaniem sztucznego zegara o zmniejszonej kompensacji hałasu i temperatury, aby lepiej zrozumieć rytmy dobowe występujące w każdej dziedzinie życia. Zakłócenie rytmów dobowych może prowadzić do utraty rytmiczności metabolicznych i transkrypcyjnych , a nawet przyspieszyć rozwój niektórych chorób neurodegeneracyjnych, takich jak Choroba Alzheimera . W 2017 roku w laboratorium stworzono oscylatory, które generowały rytmy dobowe i na które temperatura nie miała większego wpływu.

Z patologicznego punktu widzenia model represilatora można zastosować do modelowania wzrostu komórek i nieprawidłowości, które mogą się pojawić, takich jak te obecne w komórkach nowotworowych . W ten sposób można opracować nowe metody leczenia oparte na okołodobowej aktywności komórek nowotworowych. Dodatkowo w 2016 roku zespół badawczy ulepszył poprzednią konstrukcję represilatora. Po szumu (przetwarzania sygnału) autorzy przenieśli konstrukt reporterowy GFP na plazmid represilatora i usunęli znaczniki degradacji ssrA z każdego białka represorowego. Wydłużyło to okres i poprawiło regularność oscylacji represilatora.

W 2019 roku badanie udoskonaliło model Elowitza i Leiblera, udoskonalając system represilatora poprzez uzyskanie modelu z unikalnym stanem ustalonym i nową funkcją częstości. Eksperyment ten poszerzył obecną wiedzę na temat represji i regulacji genów .

Znaczenie

Biologia syntetyczna

Sztuczne represilatory odkryto poprzez wszczepienie syntetycznej pętli hamującej do bakterii E. coli . Stanowiło to pierwsze wdrożenie syntetycznych oscylacji w organizmie. Dalsze implikacje obejmują możliwość syntetycznego ratowania zmutowanych składników oscylacji w organizmach modelowych.

Sztuczny represilator jest kamieniem milowym biologii syntetycznej, który pokazuje, że genetyczne sieci regulacyjne można zaprojektować i wdrożyć w celu pełnienia nowych funkcji. Stwierdzono jednak, że po pewnym czasie oscylacje komórek utraciły fazę, a wzrost komórek miał wpływ na aktywność sztucznego represilatora. Zatem początkowy eksperyment pozwolił na nowo docenić zegar dobowy występujący w wielu organizmach, ponieważ endogenne represilatory są znacznie silniejsze niż wszczepione sztuczne represilatory. Nowe badania w Centrum Biologii Ilościowej RIKEN odkryli, że modyfikacje chemiczne pojedynczej cząsteczki białka mogą stworzyć niezależny od temperatury, samowystarczalny oscylator.

Sztuczne represilatory mogłyby potencjalnie pomóc w badaniach i leczeniu w różnych dziedzinach, od biologii okołodobowej po endokrynologię. Coraz częściej potrafią wykazać synchronizację właściwą naturalnym systemom biologicznym i czynnikom, które na nie wpływają.

Biologia okołodobowa

Lepsze zrozumienie naturalnie występującego represilatora w organizmach modelowych o endogennym rytmie dobowym, takich jak A. thaliana, ma zastosowanie w rolnictwie, szczególnie w odniesieniu do hodowli roślin i zarządzania zwierzętami.


Linki zewnętrzne

Źródło: „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Repressilator&oldid=1131296853 ”