Sekw. TCP
Sekwencjonowanie profilu kompleksu translacyjnego ( TCP-seq ) to metoda biologii molekularnej służąca do uzyskiwania migawek chwilowego rozkładu kompleksów syntezy białek wzdłuż łańcuchów informacyjnego RNA (mRNA).
Aplikacja
Ekspresja kodu genetycznego we wszystkich formach życia składa się z dwóch głównych procesów, syntezy kopii kodu genetycznego zapisanego w DNA do postaci mRNA ( transkrypcja ) oraz samej syntezy białek ( translacji ), w wyniku której kopie kodu w mRNA są dekodowane do sekwencje aminokwasowe odpowiednich białek. Zarówno transkrypcja, jak i translacja są wysoce regulowanymi procesami zasadniczo kontrolującymi wszystko, co dzieje się w żywych komórkach (i w konsekwencji w organizmach wielokomórkowych).
Kontrola translacji jest szczególnie ważna w komórkach eukariotycznych , gdzie stanowi część potranskrypcyjnych sieci regulacyjnych ekspresji genów. Ta dodatkowa funkcjonalność znajduje odzwierciedlenie w zwiększonej złożoności procesu tłumaczenia , co czyni go trudnym obiektem do zbadania. Jednak szczegóły dotyczące tego, kiedy i jaki mRNA ulega translacji oraz jakie mechanizmy są odpowiedzialne za tę kontrolę, są kluczem do zrozumienia normalnej i patologicznej funkcjonalności komórek. Do uzyskania tych informacji można użyć protokołu TCP-seq.
Zasady
Wraz z pojawieniem się wysokowydajnych metod identyfikacji sekwencji DNA i RNA (takich jak sekwencjonowanie Illumina ), stała się możliwa wydajna analiza sekwencji nukleotydowych dużej liczby stosunkowo krótkich fragmentów DNA i RNA. Sekwencje tych fragmentów można nakładać, aby zrekonstruować źródło. Alternatywnie, jeśli sekwencja źródłowa jest już znana, fragmenty można znaleźć w jej obrębie („zmapować”) i policzyć ich poszczególne liczby. Tak więc, jeśli istnieje etap początkowy, w którym fragmenty są obecne lub selekcjonowane w różny sposób („wzbogacone”), podejście to można zastosować do ilościowego opisu takiego etapu nawet w przypadku bardzo dużej liczby lub długości sekwencji wejściowych, najczęściej obejmujących całe DNA lub RNA komórki.
TCP-seq opiera się na tych możliwościach wysokowydajnego sekwencjonowania RNA i dodatkowo wykorzystuje zjawisko ochrony kwasu nukleinowego . Ochrona objawia się odpornością na depolimeryzację lub modyfikację odcinków kwasów nukleinowych (zwłaszcza RNA), które są ściśle związane lub pochłonięte przez inne biomolekuły, które w ten sposób pozostawiają swoje „ślady” na nici kwasu nukleinowego. Te fragmenty „odcisku stopy” reprezentują zatem miejsce na łańcuchu kwasu nukleinowego, w którym zachodzi interakcja. Sekwencjonowanie i mapowanie fragmentów z powrotem do sekwencji źródłowej umożliwia precyzyjne określenie lokalizacji i liczby tych międzycząsteczkowych kontaktów.
W przypadku TCP-seq rybosomy i podjednostki rybosomalne zaangażowane w interakcję z mRNA są najpierw szybko chemicznie sieciowane z formaldehydem, aby zachować istniejący stan interakcji („migawka” rozkładu) i zablokować ewentualne procesy nierównowagowe. Sieciowanie można przeprowadzić bezpośrednio w żywych komórkach, ale nie wyłącznie. Następnie RNA ulega częściowej degradacji ( np. za pomocą rybonukleazy ), tak że pozostają tylko fragmenty chronione przez rybosomy lub podjednostki rybosomalne. Zabezpieczone fragmenty są następnie oczyszczane zgodnie z sedymentacją dynamikę dołączonych rybosomów lub podjednostek rybosomów, odblokowanych, zsekwencjonowanych i zmapowanych do źródłowego transkryptomu , podając oryginalne lokalizacje kompleksów translacyjnych nad mRNA.
TCP-seq łączy kilka elementów typowych dla innych tego rodzaju analiz obejmujących cały transkryptom . W szczególności, metody profilowania polisomów i profilowania rybosomów (translacji) są również stosowane do identyfikacji mRNA zaangażowanego w tworzenie polisomów i lokalizacji wydłużających się rybosomów odpowiednio nad regionami kodującymi transkryptów. Metody te nie wykorzystują jednak chemicznej stabilizacji kompleksów translacyjnych i oczyszczania kowalencyjnie związanych związków pośrednich z żywych komórek. TCP-seq można zatem uznać bardziej za funkcjonalny odpowiednik ChIP-seq i podobne metody badania chwilowych interakcji DNA, które zostały przeprojektowane, aby można je było zastosować do translacji.
Zalety i wady
Zalety metody obejmują:
- wyjątkowo szerokie pole widzenia (ponieważ kompleksy translacyjne dowolnego typu, w tym skanowanie małych podjednostek rybosomów, są rejestrowane po raz pierwszy);
- potencjalnie bardziej naturalna reprezentacja złożonej dynamiki (ponieważ wszystkie, a nie tylko wybrane, procesy translacji są zatrzymywane przez wiązanie formaldehydu);
- możliwie wierniejsze i/lub bardziej czułe wykrywanie lokalizacji kompleksów translacyjnych (ponieważ wiązanie kowalencyjne zapobiega odrywaniu się fragmentów od rybosomów lub ich podjednostek).
Wady obejmują:
- większa ogólna złożoność procedury eksperymentalnej (ze względu na wymaganie wstępnej izolacji translowanego mRNA i preparatywnej sedymentacji w celu oddzielenia rybosomów i podjednostek rybosomów);
- większe zanieczyszczenie użytecznej głębokości odczytu sekwencjonowania niepożądanymi fragmentami rybosomalnego RNA (odziedziczone z szerokiego okna wyboru rozmiaru stosowanego dla chronionych fragmentów RNA);
- warunek wstępny optymalizacji procedury utrwalania formaldehydem dla każdej nowej komórki lub typu próbki (ponieważ optymalne czasy utrwalania formaldehydem silnie zależą od morfologii próbki, a zarówno nadmierne, jak i niedostateczne utrwalenie wpłynie negatywnie na wyniki).
Rozwój
Metoda jest obecnie opracowywana i została zastosowana do badania dynamiki translacji w żywych komórkach drożdży i raczej rozszerza, niż po prostu łączy, możliwości poprzednich technik. Jedyną inną metodą obejmującą cały transkryptom do mapowania pozycji rybosomów na mRNA z precyzją nukleotydów jest profilowanie rybosomów (translacja). Jednak wychwytuje pozycje tylko wydłużających się rybosomów, a większość dynamicznych i funkcjonalnie ważnych półproduktów translacji na etapie inicjacji nie jest wykrywana.
TCP-seq został zaprojektowany specjalnie do kierowania na te martwe punkty. Zasadniczo może zapewnić ten sam poziom szczegółowości fazy elongacji, co profilowanie rybosomów (translacji), ale obejmuje również rejestrację produktów pośrednich inicjacji, terminacji i recyklingu (i zasadniczo wszelkich innych możliwych kompleksów translacyjnych, o ile rybosom lub jego podjednostki stykają się i chronią mRNA) syntezy białek, które wcześniej pozostawały poza zasięgiem. Dlatego TCP-seq zapewnia pojedyncze podejście do pełnego wglądu w proces translacji próbki biologicznej. Można oczekiwać, że ten szczególny aspekt metody będzie dalej rozwijany, ponieważ dynamika skanowania rybosomalnego na mRNA podczas inicjacji translacji jest ogólnie nieznana przez większość życia. Bieżący zestaw danych zawierający dane TCP-seq do inicjacji translacji jest dostępny dla drożdży Saccharomyces cerevisiae i prawdopodobnie w przyszłości zostanie rozszerzony na inne organizmy.