Szybka chromatografia cieczowa białek
| Akronim | FPLC |
|---|---|
| Klasyfikacja | Chromatografia |
| Producenci | NGC System Bio-Rad Laboratories ), Arista Slice (Practichem), ĘKTA FPLC ( GE Healthcare , Pharmacia ), Contichrom (ChromaCon), BioSMB (Pall Life Sciences) |
| Inne techniki | |
| Powiązany |
Wysokosprawna chromatografia cieczowa Chromatografia powinowactwa |
Szybka chromatografia cieczowa białek (FPLC) jest formą chromatografii cieczowej , która jest często stosowana do analizy lub oczyszczania mieszanin białek. Podobnie jak w innych formach chromatografii, separacja jest możliwa, ponieważ różne składniki mieszaniny mają różne powinowactwo do dwóch materiałów, poruszającego się płynu ( faza ruchoma ) i porowatego ciała stałego ( faza stacjonarna ). W FPLC faza ruchoma jest roztworem wodnym lub „ buforem ”. Natężenie przepływu bufora jest kontrolowane przez pompę wyporową i zwykle jest utrzymywane na stałym poziomie, podczas gdy skład buforu można zmieniać, pobierając płyny w różnych proporcjach z dwóch lub więcej zewnętrznych zbiorników. Faza stacjonarna to żywica złożona z perełek, zazwyczaj z usieciowanej agarozy , umieszczona w cylindrycznej szklanej lub plastikowej kolumnie. Żywice FPLC są dostępne w szerokim zakresie rozmiarów kulek i ligandów powierzchniowych w zależności od zastosowania.
W najpowszechniejszej strategii FPLC, wymianie jonowej , żywica jest wybierana tak, aby białko będące przedmiotem zainteresowania wiązało się z żywicą poprzez interakcję ładunków w buforze A (bufor roboczy), ale uległo dysocjacji i powróciło do roztworu w buforze B (elucja bufor). Mieszaninę zawierającą jedno lub więcej białek będących przedmiotem zainteresowania rozpuszcza się w 100% buforze A i pompuje do kolumny. Białka będące przedmiotem zainteresowania wiążą się z żywicą, podczas gdy inne składniki są przeprowadzane w buforze. Całkowite natężenie przepływu buforu jest utrzymywane na stałym poziomie; jednakże udział buforu B (bufor „elucyjny”) jest stopniowo zwiększany od 0% do 100% zgodnie z zaprogramowaną zmianą stężenia („gradient”). W pewnym momencie tego procesu każde ze związanych białek dysocjuje i pojawia się w eluencie . Eluent przechodzi przez dwa detektory, które mierzą stężenie soli (poprzez przewodnictwo) i stężenie białka (poprzez absorpcję światła ultrafioletowego o długości fali 280nm). Gdy każde białko jest eluowane, pojawia się w eluencie jako „pik” stężenia białka i może być zbierane do dalszego wykorzystania.
FPLC została opracowana i wprowadzona na rynek w Szwecji przez firmę Pharmacia w 1982 roku i pierwotnie nosiła nazwę szybkiej chromatografii cieczowej , aby kontrastować ją z HPLC lub wysokosprawną chromatografią cieczową . FPLC jest ogólnie stosowany tylko do białek; jednak ze względu na szeroki wybór żywic i buforów ma szerokie zastosowanie. W przeciwieństwie do HPLC, stosowane ciśnienie buforu jest stosunkowo niskie, zazwyczaj poniżej 5 barów , ale szybkość przepływu jest stosunkowo wysoka, typowo 1-5 ml/min. FPLC można łatwo skalować od analizy miligramów mieszanin w kolumnach o całkowitej objętości 5 ml lub mniejszej do przemysłowej produkcji kilogramów oczyszczonego białka w kolumnach o objętości wielu litrów. W przypadku stosowania do analizy mieszanin eluent jest zwykle zbierany we frakcjach 1-5 ml, które można dalej analizować (na przykład za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI) ). W przypadku stosowania do oczyszczania białek mogą istnieć tylko dwa pojemniki zbiorcze: jeden na oczyszczony produkt i jeden na odpady.
Elementy systemu FPLC
Typowy laboratoryjny FPLC składa się z jednej lub dwóch precyzyjnych pomp, jednostki sterującej, kolumny, systemu detekcji i kolektora frakcji. Chociaż możliwa jest ręczna obsługa systemu, komponenty są zwykle połączone z komputerem osobistym lub, w starszych jednostkach, z mikrokontrolerem.
Lakierki
Większość systemów wykorzystuje dwie dwucylindrowe pompy tłokowe , po jednej dla każdego bufora, łącząc wydajność obu w komorze mieszania. Niektóre prostsze systemy wykorzystują pojedynczą pompę perystaltyczną , która pobiera oba bufory z oddzielnych zbiorników przez zawór dozujący i komorę mieszania. W obu przypadkach system pozwala na ciągłą zmianę frakcji każdego buforu wchodzącego do kolumny. Szybkość przepływu może wynosić od kilku mililitrów na minutę w systemach stołowych do litrów na minutę w przypadku oczyszczania na skalę przemysłową. Szeroki zakres przepływu sprawia, że nadaje się zarówno do chromatografii analitycznej, jak i preparatywnej.
Pętla wtryskowa
Pętla iniekcyjna to odcinek rurki o znanej objętości, który jest napełniany roztworem próbki przed wstrzyknięciem go do kolumny. Objętość pętli może wahać się od kilku mikrolitrów do 50 ml lub więcej.
Zawór wtryskowy
Zawór wtryskowy jest zaworem napędzanym silnikiem, który łączy mieszalnik i pętlę próbki z kolumną. Zazwyczaj zawór ma trzy pozycje do ładowania pętli próbki, wstrzykiwania próbki z pętli do kolumny oraz do podłączania pomp bezpośrednio do przewodu ściekowego w celu ich przemycia lub zmiany roztworów buforowych. Zawór wstrzykujący ma port ładowania próbki, przez który próbka może być załadowana do pętli wstrzykującej, zwykle ze strzykawki podskórnej przy użyciu złącza Luer-lock.
Kolumna
Kolumna jest szklanym lub plastikowym cylindrem wypełnionym kulkami żywicy i wypełnionym roztworem buforowym. Zwykle jest montowany pionowo ze zderzakiem płynącym w dół od góry do dołu. Szklana fryta na dnie kolumny zatrzymuje kulki żywicy w kolumnie, jednocześnie umożliwiając wydostanie się buforu i rozpuszczonych białek.
Komórka przepływowa
Eluent z kolumny przechodzi przez jedną lub więcej kuwet przepływowych w celu zmierzenia stężenia białka w eluencie (poprzez absorpcję światła UV przy 280 nm). Cela konduktometryczna mierzy przewodność buforu, zwykle w milisiemensach/cm, co wskazuje na stężenie soli w buforze. Często dołączana jest również kuweta przepływowa, która mierzy pH buforu. Zwykle każda cela przepływowa jest podłączona do oddzielnego modułu elektronicznego, który dostarcza zasilanie i wzmacnia sygnał.
Monitor/rejestrator
Komórki przepływowe są podłączone do wyświetlacza i/lub rejestratora. W starszych systemach był to prosty rejestrator wykresów, w nowoczesnych systemach używany jest komputer z interfejsem sprzętowym i wyświetlaczem. Pozwala to eksperymentatorowi zidentyfikować, kiedy występują piki stężenia białka, co wskazuje, że eluowane są określone składniki mieszaniny.
Kolektor frakcji
Kolektor frakcji jest zwykle obrotowym stojakiem, który można napełnić probówkami lub podobnymi pojemnikami. Pozwala na zbieranie próbek w ustalonych objętościach lub może być sterowany w celu kierowania określonych frakcji wykrytych jako piki stężenia białka do oddzielnych pojemników.
Wiele systemów zawiera różne komponenty opcjonalne. Filtr można dodać między mieszalnikiem a kolumną, aby zminimalizować zatykanie. W dużych kolumnach FPLC próbkę można wprowadzać do kolumny bezpośrednio za pomocą małej pompy perystaltycznej zamiast pętli iniekcyjnej. Gdy bufor zawiera rozpuszczony gaz, pęcherzyki mogą tworzyć się w wyniku spadku ciśnienia, gdy bufor opuszcza kolumnę; te bąbelki tworzą artefakty, jeśli przechodzą przez komórki przepływowe. Można temu zapobiec przez odgazowanie buforów, np. za pomocą odgazowywacza lub przez dodanie ogranicznika przepływu za komórkami przepływowymi w celu utrzymania ciśnienia 1-5 barów w przewodzie eluentu.
Kolumny FPLC
Kolumny używane w FPLC to duże rurki [mm śr. wewn.], które zawierają małe [µ] cząstki lub kulki żelowe, które są znane jako faza stacjonarna. Złoże chromatograficzne składa się z kulek żelowych wewnątrz kolumny, a próbka jest wprowadzana do iniektora i przenoszona do kolumny przez przepływający rozpuszczalnik. W wyniku przylegania lub dyfuzji różnych składników w żelu dochodzi do rozdzielenia mieszaniny próbek.
Kolumny używane z FPLC mogą rozdzielać makrocząsteczki na podstawie wielkości , rozkładu ładunku ( wymiana jonowa ), hydrofobowości, odwróconej fazy lub biorozpoznawania (jak w przypadku chromatografii powinowactwa ). W celu ułatwienia użytkowania dostępna jest szeroka gama gotowych kolumn do technik takich jak wymiana jonowa, filtracja żelowa (wykluczanie wielkości), oddziaływania hydrofobowe i chromatografia powinowactwa. FPLC różni się od HPLC tym, że kolumny używane do FPLC mogą być używane tylko do maksymalnego ciśnienia 3-4 MPa (435-580 psi). Tak więc, jeśli można ograniczyć ciśnienie HPLC, każdą kolumnę FPLC można również stosować w maszynie HPLC.
Optymalizacja oczyszczania białek
Do oczyszczania cząsteczki docelowej można zastosować kombinacje metod chromatograficznych. Celem oczyszczania białek za pomocą FPLC jest dostarczenie docelowych ilości o wystarczającej czystości w stanie biologicznie aktywnym, aby nadawały się do dalszego wykorzystania. Jakość produktu końcowego różni się w zależności od rodzaju i ilości materiału wyjściowego, wydajności separacji i selektywności żywicy oczyszczającej. Ostatecznym celem danego protokołu oczyszczania jest dostarczenie wymaganej wydajności i czystości docelowej cząsteczki w najszybszy, najtańszy i najbezpieczniejszy sposób, aby uzyskać akceptowalne wyniki. Zakres wymaganej czystości może sięgać od wymaganej do analizy podstawowej ( SDS-PAGE lub ELISA ), z usuniętymi tylko zanieczyszczeniami masowymi, do czystości wystarczającej do analizy strukturalnej ( NMR lub krystalografia rentgenowska ), zbliżając się do >99% wartości docelowej cząsteczka. Wymagana czystość może również oznaczać wystarczającą czystość, aby zachować aktywność biologiczną celu. Wymagania te można wykorzystać do określenia ilości materiału wyjściowego wymaganego do osiągnięcia celu eksperymentalnego. Jeśli materiał wyjściowy jest ograniczony i nie można przeprowadzić pełnej optymalizacji protokołu oczyszczania, wówczas oczekuje się bezpiecznego protokołu standardowego, który wymaga minimalnych kroków dostosowawczych i optymalizacyjnych. Może to nie być optymalne pod względem czasu trwania eksperymentu, wydajności i ekonomii, ale pozwoli osiągnąć cel eksperymentu. Z drugiej strony, jeśli materiał wyjściowy wystarczy do opracowania bardziej kompletnego protokołu, ilość pracy potrzebnej do osiągnięcia celu separacji zależy od dostępnych informacji o próbce i właściwości cząsteczki docelowej. Ograniczenia w opracowywaniu protokołów oczyszczania wiele razy zależą od źródła oczyszczanej substancji, czy to ze źródeł naturalnych (na przykład zebrane tkanki lub organizmy), źródeł rekombinowanych (takich jak wykorzystanie wektorów prokariotycznych lub eukariotycznych w ich odpowiednich systemach ekspresji), lub całkowicie syntetycznych źródeł.
Żadna technika chromatograficzna nie zapewnia 100% wydajności materiału aktywnego, a ogólna wydajność zależy od liczby etapów w protokole oczyszczania. Optymalizując każdy krok do zamierzonego celu i rozmieszczając je tak, aby zminimalizować zabiegi między etapami, liczba kroków zostanie zminimalizowana.
Typowy wieloetapowy protokół oczyszczania rozpoczyna się od wstępnego etapu wychwytywania, który często wykorzystuje chromatografię jonowymienną (IEC). Żywica nośnika (faza stacjonarna) składa się z kulek, których rozmiary wahają się od dużych (dobrych do dużych prędkości przepływu i niewielkiego lub zerowego klarowania próbki kosztem rozdzielczości) do małych (dla najlepszej możliwej rozdzielczości przy równych wszystkich innych czynnikach) . Krótka i szeroka geometria kolumn jest podatna na wysokie natężenia przepływu również kosztem rozdzielczości, zwykle z powodu bocznej dyfuzji próbki na kolumnie. Aby techniki takie jak chromatografia wykluczania były przydatne, wymagane są bardzo długie, cienkie kolumny i minimalne objętości próbek (maksymalnie 5% objętości kolumny). Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) może być również stosowana w pierwszym i/lub pośrednim etapie. Selektywność w HIC jest niezależna od bieżącego pH i stosuje się malejące gradienty soli. W przypadku HIC kondycjonowanie polega na dodaniu do próbki siarczanu amonu w celu dopasowania stężenia buforu A. Jeśli HIC jest stosowany przed IEC, siłę jonową należy obniżyć, aby dopasować ją do siły jonowej buforu A dla etapu IEC przez rozcieńczanie, dializę lub wymianę buforu przez filtrację żelową. Dlatego IEC jest zwykle przeprowadzana przed HIC, ponieważ warunki elucji o wysokiej zawartości soli dla IEC są idealne do wiązania żywic HIC w następnym etapie oczyszczania. Polerowanie jest stosowane w celu osiągnięcia wymaganego końcowego poziomu oczyszczenia i jest zwykle przeprowadzane na kolumnie do filtracji żelowej. Można dodać dodatkowy pośredni etap oczyszczania lub przeprowadzić optymalizację różnych etapów w celu poprawy czystości. Ten dodatkowy krok zwykle wiąże się z kolejną rundą IEC w zupełnie innych warunkach.
Chociaż jest to przykład wspólnego protokołu oczyszczania białek, warunki buforowe, szybkości przepływu i żywice stosowane do osiągnięcia ostatecznych celów można wybrać tak, aby obejmowały szeroki zakres docelowych białek. Ta elastyczność jest niezbędna dla funkcjonalnego systemu oczyszczania, ponieważ wszystkie białka zachowują się inaczej i często odbiegają od przewidywań.
Linki zewnętrzne
Przykładowa ocena ryzyka FPLC (Leeper Group, University of Cambridge)