Tandemowe oczyszczanie powinowactwa

Tandemowe oczyszczanie powinowactwa ( TAP ) to technika oczyszczania oparta na immunoprecypitacji , służąca do badania interakcji białko-białko . Celem jest wyekstrahowanie z komórki tylko białka będącego przedmiotem zainteresowania, w kompleksie z innymi białkami, z którymi wchodzi w interakcje. TAP wykorzystuje dwa rodzaje agarozowych , które wiążą się z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania i które można oddzielić od lizatu komórkowego przez wirowanie, bez zakłócania, denaturowania lub zanieczyszczenia zaangażowanych kompleksów. Jest to możliwe, aby białko będące przedmiotem zainteresowania związało się z kulkami oznaczony zaprojektowanym elementem, metką TAP.

Oryginalna metoda TAP obejmuje fuzję znacznika TAP z C-końcem badanego białka. Znacznik TAP składa się z trzech składników: kalmodulinę (CBP), miejsca cięcia proteazy TEV i dwóch domen białka A , które ściśle wiążą się z IgG (czyniąc znacznik TAP rodzajem znacznika epitopowego ).

Od czasu pierwszego opublikowania zasady TAP zaproponowano wiele innych kombinacji znacznika/kulek/eluentu.

Znaczniki wariantów

Ten znacznik jest również znany jako znacznik C-końcowy TAP, ponieważ dostępna jest również wersja N-końcowa . Jednak sposób, który ma zostać opisany, zakłada użycie znacznika C-końcowego, chociaż zasada stojąca za sposobem jest wciąż taka sama.

Historia

Znakowanie TAP zostało wynalezione przez zespół badawczy pracujący w Europejskim Laboratorium Biologii Molekularnej pod koniec lat 90. (Rigaut i in., 1999, Puig i in., 2001) i zaproponowane jako nowe narzędzie do eksploracji proteomu. Zespół wykorzystał go do scharakteryzowania kilku kompleksów białkowych (Rigaut i in., 1999, Caspary i in. 1999, Bouveret i in., 2000, Puig i in., 2001). Pierwsze zastosowanie tej techniki na dużą skalę miało miejsce w 2002 roku, kiedy zespół badawczy współpracował z naukowcami z firmy proteomicznej Cellzome, aby opracować wizualną mapę interakcji ponad 230 kompleksów wielobiałkowych w komórce drożdży poprzez systematyczne znakowanie tagiem TAP do każdego białka. Pierwsze udane doniesienie o zastosowaniu technologii tagów TAP w roślinach pojawiło się w 2004 roku (Rohila i in., 2004,)

Proces

Istnieje kilka metod wprowadzania białka fuzyjnego do komórek gospodarza. Jeśli gospodarzem są drożdże , wówczas jedną z metod może być użycie plazmidów , które ostatecznie dokonają translacji białka fuzyjnego w gospodarzu. Niezależnie od stosowanej metody, korzystne jest utrzymywanie ekspresji białka fuzyjnego tak blisko jego naturalnego poziomu, jak to tylko możliwe. Po translacji białka fuzyjnego w gospodarzu będzie ono oddziaływać z innymi białkami, najlepiej w sposób, na który nie ma wpływu znacznik TAP.

Następnie znakowane białko (wraz z partnerami wiążącymi) jest odzyskiwane przy użyciu procesu selekcji powinowactwa .

Pierwszy rodzaj dodanej kuleczki jest pokryty immunoglobuliną G , która wiąże się z najbardziej zewnętrznym końcem znacznika TAP. Perełki z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania oddziela się od lizatu przez wirowanie. Białka są następnie uwalniane z kulek przez enzym ( proteazę TEV ), który rozbija znacznik w miejscu cięcia TEV w środku.

do uwolnionych białek dodaje się kulkę drugiego typu (pokrytą kalmoduliną ), która wiąże się odwracalnie z pozostałą częścią znacznika TAP wciąż na białkach. Perełki są ponownie rozdzielane przez wirowanie, w celu dalszego usunięcia zanieczyszczeń, jak również proteazy TEV. Na koniec kulki są uwalniane przez EGTA , pozostawiając natywny eluat zawierający tylko białko będące przedmiotem zainteresowania, związane z nim białka partnerskie i pozostałą część CBP znacznika TAP.

Natywny eluat można następnie analizować za pomocą elektroforezy żelowej i spektrometrii masowej w celu zidentyfikowania partnerów wiążących białka.

Zalety

Zaletą tej metody jest to, że można rzeczywiście określić ilościowo partnerów białkowych in vivo bez wcześniejszej wiedzy o złożonym składzie. Jest również prosty w wykonaniu i często zapewnia wysoką wydajność. Jedną z przeszkód w badaniu interakcji białek z białkami jest zanieczyszczenie docelowego białka, zwłaszcza gdy nie mamy o tym żadnej wcześniejszej wiedzy. TAP oferuje skuteczny i wysoce specyficzny sposób oczyszczania białka docelowego. Po 2 kolejnych oczyszczaniach metodą powinowactwa znacznie zmniejsza się szansa na zatrzymanie zanieczyszczeń w eluacie.

Niedogodności

Istnieje jednak również możliwość, że znacznik dodany do białka może przesłonić wiązanie nowego białka z jego oddziałującymi partnerami. Ponadto znacznik może również wpływać na poziomy ekspresji białka. Z drugiej strony, znacznik może również nie być wystarczająco wystawiony na działanie kulek powinowactwa, stąd zniekształcenie wyników.

Może również istnieć możliwość rozszczepienia białek przez proteazę TEV , chociaż jest to mało prawdopodobne, biorąc pod uwagę wysoką specyficzność proteazy TEV.

Stosowność

Ponieważ ta metoda obejmuje co najmniej 2 rundy przemywania, może nie być odpowiednia do badania przejściowych interakcji białek, w przeciwieństwie do metody dwuhybrydowej drożdży lub sieciowania in vivo z fotoreaktywnymi analogami aminokwasów . Jest to jednak dobra metoda testowania stabilnych oddziaływań białek i pozwala na różne stopnie badania poprzez kontrolowanie, ile razy kompleks białkowy jest oczyszczany.

Aplikacje

W 2002 roku tag TAP został po raz pierwszy użyty ze spektrometrią mas w podejściu na dużą skalę do systematycznej analizy proteomiki drożdży poprzez charakteryzację kompleksów wielobiałkowych. Badanie ujawniło 491 kompleksów, w tym 257 zupełnie nowych. Reszta była znana z innych badań, ale teraz okazało się, że praktycznie wszystkie z nich mają nowe komponenty. Sporządzili mapę łączącą funkcjonalnie wszystkie składniki białkowe w złożonej sieci.

Wiele innych analiz proteomicznych również obejmuje użycie znacznika TAP. Badania przeprowadzone przez EMBO (Dziembowski, 2004) zidentyfikowały nowy kompleks wymagany do retencji i splicingu jądrowego pre-mRNA. Naukowcy oczyścili nowy trimeryczny kompleks składający się z 3 innych podjednostek (Snu17p, Bud13p i Pml1p) i stwierdzili, że podjednostki te nie są niezbędne do przeżycia, ale są niezbędne do wydajnego splicingu (usuwania intronów) pre-mRNA. W 2006 roku Fleischer i in. systematycznie identyfikowane białka związane z eukariotycznymi kompleksami rybosomalnymi. Wykorzystali wielopłaszczyznowe ekrany proteomiczne spektrometrii mas do identyfikacji drożdżowych kompleksów rybosomalnych, a następnie wykorzystali znakowanie TAP do funkcjonalnego połączenia wszystkich tych białek.

Inne kombinacje epitop-znacznik

Zasada oczyszczania tandemowego powinowactwa kompleksów wielobiałkowych nie ogranicza się do kombinacji znaczników CBP i białka A stosowanych w oryginalnej pracy Rigauta i in. (1999). Na przykład połączenie znaczników FLAG i HA było stosowane od 2000 r. przez grupę Nakatani do oczyszczania licznych kompleksów białkowych z komórek ssaków. Od czasu opublikowania zasady TAP zaproponowano wiele innych kombinacji znaczników.