Typowanie fagowe

Kultura bakterii zakażonych bakteriofagami, „dziury” to obszary, w których bakterie zostały zabite przez wirusa. Kultura ma średnicę 10 cm.

Typowanie fagowe to metoda fenotypowa wykorzystująca bakteriofagi (w skrócie „fagi”) do wykrywania i identyfikacji pojedynczych szczepów bakterii . Fagi to wirusy infekujące bakterie i mogące prowadzić do lizy komórek bakteryjnych . Szczepowi bakteryjnemu przypisywany jest typ na podstawie jego wzorca lizy. Typowanie fagowe było używane do śledzenia źródła epidemii zakaźnych w XX wieku, ale zostało zastąpione metodami genotypowymi, takimi jak sekwencjonowanie całego genomu w celu charakterystyki epidemiologicznej .

Zasada

Typowanie fagów opiera się na specyficznym wiązaniu fagów z antygenami i receptorami na powierzchni bakterii i wynikającej z tego lizie bakterii lub jej braku. Proces wiązania jest znany jako adsorpcja. Gdy fag zaadsorbuje się na powierzchni bakterii, może przejść cykl lityczny lub cykl lizogeniczny.

Zjadliwe fagi wchodzą w cykl lityczny, w którym replikują się i dokonują lizy komórki bakteryjnej. Zjadliwe fagi mogą różnicować różne gatunki bakterii na podstawie ich specyficznego działania litycznego. Liza nastąpi tylko wtedy, gdy zjadliwy fag zaadsorbuje się na powierzchni bakterii, konfigurując specyficzność gatunkową fagów.

Umiarkowane fagi wchodzą w cykl lizogeniczny i nie powodują natychmiastowej lizy komórki. Zamiast tego fag jest zintegrowany z genomem bakterii jako profag podczas lizogenizacji, co chroni komórkę przed lizą przez fagi, które są serologicznie identyczne lub spokrewnione. Ponieważ jest włączony do genomu, profag jest również przekazywany potomstwu bakterii. Szczep bakterii przenoszący profag jest znany jako szczep lizogeniczny. Lizogenizacja jest specyficzna dla szczepu, więc pozwala na różnicowanie różnych szczepów bakterii w obrębie tego samego gatunku. Profag może być indukowany chemicznie lub fizycznie, aby powrócił do szlaku litycznego.

metoda

Szczep bakteryjny, który ma być scharakteryzowany, hoduje się na szalce agarowej Petriego i suszy. Po wyschnięciu na podstawie rysuje się siatkę lub inny rozpoznawalny wzór, aby zaznaczyć różne regiony. Każdy region inokuluje się innym fagiem w jego rutynowym rozcieńczeniu testowym, a następnie inkubuje przez 5-48 godzin. Wrażliwe regiony faga będą wykazywać prześwit w miejscu, w którym bakterie zostały poddane lizie, co jest wykorzystywane do różnicowania. Wielkość, morfologia i wzór obszaru poddanego lizie są ważnymi kryteriami różnicowania gatunków i szczepów bakterii. Porównuje się je ze standardowym schematem wzorców lizy w celu przypisania typu do szczepu.

Rutynowe rozcieńczenie testowe (RTD)

Rutynowe rozcieńczenie testowe (RTD) jest zwykle definiowane jako najniższe rozcieńczenie faga, które nadal powoduje lizę gospodarza. Ta technika zapobiega zjawisku znanemu jako „liza z zewnątrz”, czyli lizie bakteryjnej indukowanej raczej przez adsorpcję fagów o dużej liczebności niż przez replikację faga.

Historia

Pierwsze odnotowane użycie bakteriofagów do identyfikacji bakterii miało miejsce w 1925 r., Kiedy Sonnenschein użył fagów duru brzusznego i paratyfusowego do diagnozowania duru brzusznego. W 1934 roku odkryto, że niektóre szczepy Salmonella typhi wykazywały antygeny Vi na powierzchni. Doprowadziło to do wyizolowania fagów Vi zdolnych do lizy szczepów bakterii duru brzusznego, ale tylko wtedy, gdy wykazywały antygen Vi, umożliwiając różnicowanie gatunków duru brzusznego wykazujących ekspresję antygenu Vi i tych, które go nie wykazują.

W 1938 roku Craigie i Yen zaadaptowali fagi Vi poprzez selektywne namnażanie i wykorzystali je w krytycznych rozcieńczeniach testowych do rozróżnienia 11 typów B. typhosus . W 1943 Felix i Callow rozszerzyli tę metodę na paratyphi B. w 1943 roku i wyróżnił 12 typów z 11 fagami. Międzynarodowy Komitet ds. Typowania Fagów Jelitowych został utworzony w 1947 r., a te metody typowania fagowego zostały wkrótce ujednolicone.

Ulepszenia specyficzności schematów typowania fagów były wprowadzane przez kilka następnych dziesięcioleci. W 1959 roku Callow udoskonaliła swój początkowy schemat, aby rozróżnić 34 typy Salmonella typhimurium za pomocą 29 fagów. W 1977 roku Anderson z Enteric Reference Laboratory w Londynie rozszerzył tę liczbę do 207 typów. Od tego czasu opracowano schematy typowania fagów dla Salmonella typhi , Salmonella paratyphi B. , Salmonella typhimurium , Shigella sonnei , Staphylococcus aureus i Escherichia coli , by wymienić tylko kilka.

Ograniczenia

Typowanie fagowe wymaga użycia szerokiej liczby fagów, dlatego jest zwykle używane tylko w laboratoriach referencyjnych. Opiera się również na interpretacji indywidualnego wzorca lizy i porównaniu ze standardem, co w przeszłości prowadziło do sprzecznych wyników z różnych laboratoriów. Ponadto bakteriofagi mutują, więc należy zachować fagi referencyjne.

Izolacja faga

Fagi stosowane do typowania fagowego są na ogół izolowane z natywnych siedlisk szczepu bakteryjnego gospodarza. Mogą to być ścieki, odchody, gleba i woda. Umiarkowane fagi można izolować z samej bakterii, ponieważ jest ona włączana do genomu bakteryjnego podczas lizogenizacji.