Analiza chiralna
Analiza chiralna odnosi się do ilościowego oznaczania składowych enancjomerów racemicznych substancji leczniczych lub związków farmaceutycznych. Inne powszechnie używane synonimy obejmują analizę enancjomeryczną , analizę enancjomeryczną i analizę enancjoselektywną . Analiza chiralna obejmuje wszystkie procedury analityczne ukierunkowane na charakterystykę właściwości leków chiralnych . Analiza chiralna jest zwykle przeprowadzana za pomocą chiralnych metod rozdzielania, w których enancjomery są rozdzielane na skalę analityczną i jednocześnie oznaczane dla każdego enancjomeru.
Wiele związków o znaczeniu biologicznym i farmakologicznym jest chiralnych. Właściwości farmakodynamiczne, farmakokinetyczne i toksykologiczne enancjomerów racemicznych leków chiralnych znacznie się rozszerzyły i stały się kluczową kwestią zarówno dla przemysłu farmaceutycznego, jak i agencji regulacyjnych. Zazwyczaj jeden z enancjomerów jest bardziej aktywny farmakologicznie ( eutomer ). W kilku przypadkach w przypadku nieaktywnego enancjomeru ( dystomeru ) mogą wystąpić niepożądane skutki uboczne, a nawet efekty toksyczne. Nawet jeśli skutki uboczne nie są tak poważne, nieaktywny enancjomer musi zostać zmetabolizowany, co stanowi niepotrzebne obciążenie dla i tak już zestresowanego organizmu pacjenta. Duże różnice w aktywności pomiędzy enancjomerami ujawniają potrzebę dokładnej oceny czystości enancjomerycznej farmaceutyków, agrochemikaliów i innych związków chemicznych, takich jak substancje zapachowe i smakowe. Co więcej, w momencie umieszczenia racemicznego środka terapeutycznego w układzie biologicznym, środowisku chiralnym, nie jest to już 50:50 z powodu procesu enancjoselektywnej absorpcji, dystrybucji, metabolizmu i eliminacji (ADME). Stąd, aby śledzić indywidualny profil enancjomeryczny, potrzebne jest narzędzie do analizy chiralnej.
Technologia chiralna jest aktywnym tematem związanym z syntezą asymetryczną i analizą enancjoselektywną, szczególnie w dziedzinie chromatografii chiralnej . W wyniku postępów w technologii chiralnej wiele farmaceutyków sprzedawanych obecnie jako leki racemiczne przechodzi ponowną ocenę jako chiralne specyficzne produkty lub chiralne przełączniki . Pomimo wyboru promowania pojedynczego enancjomeru lub leku racemicznego, w obecnym środowisku regulacyjnym zaistnieje potrzeba badań enancjoselektywnych. Stanowi to duże wyzwanie dla analityków farmaceutycznych i chromatografów zaangażowanych w proces opracowywania leków. W badaniach i rozwoju farmaceutycznym może być wymagana stereochemiczna metodologia analityczna do zrozumienia enancjoselektywnego działania i rozmieszczenia leków, oceny czystości chiralnej, badania stabilności stereochemicznej podczas formułowania i produkcji, oceny postaci dawkowania, enancjospecyficznej biodostępności i badań biorównoważności leków chiralnych. Oprócz zastosowań farmaceutycznych analiza chiralna odgrywa ważną rolę w badaniu próbek biologicznych i środowiskowych, a także w medycynie sądowej. Metody i zastosowania analizy chiralnej w okresie od 2010 do 2020 roku zostały ostatnio szczegółowo omówione. LCGC zawiera wiele artykułów, felietonów i wywiadów dotyczących pojawiających się trendów w analizie chiralnej i jej zastosowania w procesie odkrywania i opracowywania leków.
Do badania chiralnego potrzebne jest odpowiednie środowisko chiralne. Można to zapewnić jako płaskie światło spolaryzowane, dodatkowy związek chiralny lub wykorzystując wrodzoną chiralność natury. Chiralne strategie analityczne obejmują fizyczne, biologiczne i separacyjne techniki naukowe. Ostatnio zgłoszono absolutną chiralną analizę opartą na optyce. Najczęściej stosowaną techniką analizy enancjoselektywnej są techniki separacji, w szczególności metody chromatografii chiralnej lub chromatografia chiralna. Obecnie na rynku dostępna jest szeroka gama CSP opartych na różnych selektorach chiralnych, w tym polisacharydach, cyklodekstrynach, antybiotykach glikopeptydowych, białkach, Pirkle, eterach koronowych itp. W celu uzyskania analizy cząsteczek chiralnych.
Chromatografia chiralna
Termin ten stał się bardzo popularny i powszechnie stosowany w praktyce. Ale odpowiednim wyrażeniem jest „chromatografia enancjoselektywna”. Chromatografia chiralna rozwinęła się i stała się najbardziej preferowaną techniką oznaczania czystości enancjomerycznej, a także rozdzielania czystych enancjomerów zarówno w skali analitycznej, jak i preparatywnej. Chiralny test chromatograficzny jest pierwszym krokiem w każdym badaniu dotyczącym enancjoselektywnej syntezy lub separacji. Obejmuje to stosowanie technik tj. chromatografia gazowa (GC), wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), chiralna chromatografia w płynie nadkrytycznym (SFC), elektroforeza kapilarna (CE) i chromatografia cienkowarstwowa (TLC). Wyniki przeprowadzonego przeglądu literatury identyfikują testy chiralne oparte na HPLC jako najbardziej dominującą technologię w użyciu. Przegląd różnych metod analitycznych wykorzystywanych do rozdzielania i analizy chiralnej przedstawiono w tabeli.
| metoda | Krótki opis zasady i zastosowania |
|---|---|
| chromatograficzny | |
| Chiralna HPLC | Chiralna HPLC jest stosowana do rozdzielania enancjomerów w trybie rozdziału bezpośredniego lub pośredniego. Szeroko stosowany do sprawdzania czystości enancjomerycznej, pod warunkiem, że dostępne są wzorce odniesienia racematu lub dwóch enancjomerów. Zdolne do rozróżniania enancjomerów i racematu; (+) od (-) i (±) |
| Chiralna GC | Większość rozdziałów chiralnych za pomocą GC przeprowadza się z pochodnymi cyklodekstryny jako selektorem chiralności. Metodę tę można stosować do rozróżniania enancjomerów i racematu; (+) od (-) i (±) |
| Chromatografia cieczowa w stanie nadkrytycznym (SFC) | Zasada jest bardzo podobna do HPLC. Ale SFC zazwyczaj wykorzystuje dwutlenek węgla jako fazę ruchomą. Stąd istnieje potrzeba zwiększenia ciśnienia w całej chromatograficznej ścieżce przepływu. SFC może odróżnić enancjomery i enancjomer od racematu; (+) od (-) i (±) |
| Chiralna elektroforeza kapilarna (CE) | Chiralna CE opiera się w dużej mierze na rozdzielaniu enancjomerów poprzez tworzenie kompleksów z cyklodekstrynami, które są stosowane jako selektor chiralny. Potrafi odróżnić enancjomery od racematu; (+) od (-) i (±) |
| spektroskopowe | |
| Polarymetria | Polarymetria wykorzystuje wrodzoną właściwość cząsteczek chiralnych do obracania światła spolaryzowanego w płaszczyźnie w równym i przeciwnym kierunku. Metodę tę można stosować do rozróżniania enancjomerów i racematu; (+) od (-) i (±) |
| Optyczna dyspersja rotacyjna (ORD) | ORD jest krzywą otrzymaną przez wykreślenie zmierzonej aktywności optycznej chiralnego związku w funkcji długości fali użytego światła. Rozróżnić enancjomery i racemat; (+) od (-) i (±) |
Dichroizm kołowy (CD) |
CD mierzy zróżnicowaną absorpcję lewego i prawego światła spolaryzowanego kołowo przez związek chiralny. Te techniki chiroptyczne można zastosować do identyfikacji i/lub określenia enancjomerów |
| Jądrowy rezonans magnetyczny (NMR) | Spektroskopia NMR wykonana przy użyciu chiralnych odczynników przesuwających lub chiralnych odczynników solwatujących. Zdolny do rozróżniania enancjomerów, jak również racematu |
| Podczerwień (IR) | Zróżnicować racemat i jego enancjomery, ale nie między parą enancjomerów; (+) lub (-) od (±) |
| Kalorymetria | |
| Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) | Podstawową zasadą jest pomiar energii pochłoniętej lub wydzielonej przez próbkę w funkcji temperatury. Dane mogą odróżnić enancjomer od racematu, ale nie jeden enancjomer od jego lustrzanego maga |
Zasada - rozdzielanie enancjomerów
W środowisku izotopowym/achiralnym enancjomery wykazują identyczne właściwości fizykochemiczne, a zatem są nie do odróżnienia w tych warunkach. Wyzwaniem dla rozdziału cząsteczek chiralnych jest skonstruowanie odpowiedniego środowiska chiralnego. W systemie chromatograficznym istnieją trzy zmienne, a mianowicie chiralny analit (CA), faza ruchoma i faza stacjonarna, którymi można manipulować, aby zapewnić kluczowe środowisko chiralne. Strategia polega na tym, aby te zmienne wchodziły w interakcję z chiralnym substancją pomocniczą (selektor chiralny, CS), w wyniku czego tworzy ona kompleks diastereoizomeryczny, który ma różne właściwości fizykochemiczne i umożliwia rozdzielenie enancjomerów. W oparciu o charakter kompleksu diastereomerycznego utworzonego między gatunkami CS-CA, mitologie separacji enancjomerów są klasyfikowane jako pośredni i bezpośredni tryb separacji enancjomerów
Pośredni rozdział enancjomeru
Pośrednia separacja enancjomerów obejmuje interakcję między chiralnym analitem (CA) będącym przedmiotem zainteresowania a odpowiednim reaktywnym CS (w tym przypadku jest to enancjomerycznie czysty chiralny środek derywatyzujący, CDA) prowadzącą do powstania kowalencyjnego kompleksu diastereomerycznego, który można rozdzielić za pomocą achiralnego technika chromatograficzna. Środki terapeutyczne często zawierają w swoich strukturach reaktywne grupy funkcyjne (kwasy aminowe, hydroksylowe, epoksydowe, karbonylowe, karboksylowe itp.). Są one przekształcane w kowalencyjnie związane pochodne diastereoizomeryczne przy użyciu enancjomerycznie czystego chiralnego czynnika derywatyzującego. Powstałe w ten sposób diastereoizomery, w przeciwieństwie do enancjomerów, wykazują odmienne właściwości fizykochemiczne w środowisku achiralnym i ostatecznie rozdzielają się w wyniku zróżnicowanego czasu retencji na fazie stacjonarnej. Powodzenie tego podejścia zależy od dostępności stabilnego enancjomerycznie czystego chiralnego czynnika derywatyzującego (CDA) oraz od obecności odpowiedniej reaktywnej grupy funkcyjnej w chiralnej cząsteczce leku do kowalencyjnego tworzenia pochodnej diastereoizomerycznej. Reakcja racemicznego, (R,S)- leku z chiralnie i chemicznie czystym chiralnym środkiem derywatyzującym, (R')-CDA, da produkty diastereomeryczne, (R)-lek-(R')-CDA + (S )-lek-(R')- CDA. Schemat reakcji chiralnej derywatyzacji przedstawiono w ramce po prawej stronie.
W przeciwieństwie do enancjomerów, diastereoizomery mają różne właściwości fizykochemiczne, które sprawiają, że można je rozdzielić na regularnych achiralnych fazach stacjonarnych. Główną zaletą metodologii pośredniej jest to, że do rozdziału wytworzonych diastereoizomerów można zastosować konwencjonalny achiralny układ faza stacjonarna/faza ruchoma. W związku z tym dostępna jest znaczna elastyczność warunków chromatograficznych w celu osiągnięcia pożądanego rozdziału i wyeliminowania zakłóceń pochodzących od metabolitów i substancji endogennych. Ponadto czułość metody można zwiększyć poprzez rozsądny dobór CDA i chromatograficznego układu detekcji. Ale to pośrednie podejście do analizy enancjomerycznej ma pewne potencjalne problemy. Obejmują one dostępność odpowiedniej grupy funkcyjnej na enancjomerze do derywatyzacji, czystość enancjomeryczną CDA, racemizację CDA podczas derywatyzacji i racemizację analitu podczas derywatyzacji. Obecnie jednak stosowanie pośrednich metod analitycznych spada.
Bezpośredni rozdział enancjomerów
Bezpośrednie rozdzielanie enancjomerów obejmuje tworzenie raczej przejściowego niż kowalencyjnego kompleksu diastereomerycznego między chiralnym selektorem/dyskryminatorem a analitem (enancjomerem leku). W tym podejściu subtelne różnice energii między odwracalnie utworzonymi niekowalencyjnymi kompleksami diastereomerycznymi są wykorzystywane do rozpoznawania chiralnego. Bezpośredni chromatograficzny rozdział enancjomerów można osiągnąć na dwa różne sposoby, chiralny dodatek fazy ruchomej i tryb chiralnej fazy stacjonarnej.
Chiralny dodatek do fazy ruchomej (CMPA)
W tym podejściu do fazy ruchomej dodaje się enancjomerycznie czysty związek, selektor chiralny, a rozdzielanie odbywa się na konwencjonalnej kolumnie achiralnej. Gdy mieszanina enancjomerów jest wprowadzana do układu chromatograficznego, poszczególne enancjomery tworzą przejściowe kompleksy diastereoizomeryczne z dodatkiem chiralnej fazy ruchomej. W technice chiralnej fazy ruchomej mogą działać dwa możliwe mechanizmy: jedną z możliwości jest to, że CMPA i enancjomery mogą tworzyć diastereoizomery w fazie ruchomej. Innym jest to, że faza stacjonarna może być pokryta CMPA, co prowadzi do interakcji diastereoizomerycznych z parami enancjomerycznymi podczas procesu rozdziału chromatograficznego. Obserwuje się, że oba mechanizmy mogą zachodzić w zależności od charakterystyki zastosowanej fazy stacjonarnej i ruchomej. Ostatnio ta metoda znajduje ograniczone zastosowanie.
Chiralna faza stacjonarna (CSP)
W bezpośredniej separacji enancjomerów najbardziej popularnym podejściem jest zastosowanie chiralnych faz stacjonarnych. W tym przypadku miejsce selektora chiralnego znajduje się w fazie stacjonarnej. Faza stacjonarna składa się z obojętnego stałego nośnika (zwykle mikrocząstek krzemionki), na powierzchni którego pojedynczy enancjomer cząsteczki chiralnej (selektor) jest powlekany/adsorbowany lub chemicznie związany i który tworzy chiralną fazę stacjonarną. Powszechnie stosowane selektory chiralne obejmują polisacharydy, białka, cyklodekstryny itp. Interesujący przegląd rozwoju i zastosowania chiralnej fazy stacjonarnej w analizie chiralnej pojawił się w LCGC , 2011.
Rozpoznawanie chiralne
Rozpoznawanie chiralne implikuje zdolność chiralnych faz stacjonarnych do różnych interakcji z cząsteczkami w lustrzanym odbiciu, co prowadzi do ich rozdzielenia. Mechanizm rozdzielania enancjomerów przy użyciu CSP jest generalnie przypisywany „trzypunktowemu” modelowi interakcji (rys. 1.) między analitem a selektorem chiralnym w fazie stacjonarnej. Znany również jako model Dalgliesha. W ramach tego modelu dla chiralnego rozpoznawanie, a tym samym rozdzielanie enancjomerów, aby zachodziło na CSP, jeden z enancjomerów analitu musi być zaangażowany w trzy jednoczesne interakcje.Oznacza to, że jeden z enancjomerów może mieć dobrą interakcję z miejscami komplementarnymi na przyłączonym selektorze chiralnym do CSP. Podczas gdy jego partner w lustrzanym odbiciu może oddziaływać tylko w dwóch lub jednym takim miejscu. Na rysunku enancjomer (a) ma prawidłową konfigurację ligandów (X, Y i Z) dla trójpunktowych interakcji z komplementarne miejsca (X', Y' i Z') na CSP, podczas gdy jego lustrzane odbicie (b) może wchodzić w interakcje tylko w jednym miejscu. Linie przerywane (-----) wskazują interakcję z komplementarnymi witrynami.
Utworzone w ten sposób kompleksy diastereoizomeryczne będą miały różne energie oddziaływania. Enancjomer tworzący bardziej stabilny kompleks będzie miał mniej energii i dłużej pozostanie w fazie stacjonarnej w porównaniu z mniej stabilnym kompleksem o wyższej energii. Sukces separacji chiralnej zasadniczo zależy od manipulowania subtelnymi różnicami energii między odwracalnie utworzonymi niekowalencyjnymi przejściowymi kompleksami diastereomerycznymi. Różnica energii odzwierciedla wielkość enancjoselektywności. Faza ruchoma odgrywa główną rolę w stabilizowaniu kompleksu diastereomerycznego, a tym samym w rozdzielaniu chiralnym. Ten uproszczony model interakcji dwucząsteczkowych jest zabiegiem odpowiednim do celów teoretycznych. Faza ruchoma odgrywa kluczową rolę w chiralnym mechanizmie rozpoznawania. Składniki MP (takie jak rozpuszczalniki objętościowe, modyfikatory, sole buforowe, dodatki) wpływają nie tylko na elastyczność konformacyjną cząsteczek CS i CA, ale także na stopień ich jonizacji. Rodzaje interakcji zaangażowanych w interakcję analitu z selektorem różnią się w zależności od rodzaju zastosowanego CSP. Mogą one obejmować wiązania wodorowe, dipol-dipol, π-π, oddziaływania elektrostatyczne, hydrofobowe lub steryczne oraz tworzenie kompleksów inkluzyjnych.
Klasyczne selektory chiralne i CSP
Intensywne badania nad opracowaniem wydajnych selektorów chiralnych zaowocowały syntezą ponad 1400 CSP, a ponad 200 CSP zostało skomercjalizowanych i dostępnych na rynku. Najczęściej stosowane selektory chiralne są skategoryzowane i przedstawione w tabeli.
| Rodzaj CSP | Chemia | Chiralny mechanizm różnicowania |
Ładowność
mg/g (CSP) |
| Polimer | Polisacharydy | wiązanie H, oddziaływania dipol-dipol; Ważną rolę odgrywają również kompleksy jonów inkluzyjnych | 5-150 |
| Białka | Oddziaływania hydrofobowe i elektrostatyczne | 0,1 - 0,2 | |
| Makrocykle | Rodzimy i derywatyzowane cyklodekstryny |
kompleksy inkluzyjne, wiązanie H; substancja rozpuszczona wchodzi do wnęk w CSP, tworząc kompleksy inkluzyjne | 0,1 - 0,5 |
| Antybiotyki glikopeptydowe | wiązanie H; oddziaływania π-π, uwalnianie dipoli; steryczny; kieszeń hydrofobowa | 0,1 - 0,5 | |
| Etery koronowe | 0,1 - 0,5 | ||
| Niska masa cząsteczkowa rusztowania |
typ Pirkle'a | wiązanie H; Oddziaływania π-π, uwalnianie dipoli | 1-50 |
| Wymiana ligandów | Kompleksy koordynacyjne z metalami | 0,1 - 0,5 |
polisacharydowe CSP
Tło
Zaskakujące jest to, że w 1980 roku na rynku nie było dostępnej jednej chiralnej fazy stacjonarnej do przeprowadzania chromatografii chiralnej. Jednak pod koniec lat 80-tych temat chromatografii enancjoselektywnej wzbudził rosnące zainteresowanie, szczególnie pod wpływem instytucji Okamoto w Japonii, zespołów Pirkle i Armstrong w USA, Schurig i König w Niemczech, Lindner w Austrii i Francotte w Szwajcaria . Polisacharydy , tworzą najobficiej występujące chiralne polimery na ziemi. Te naturalnie występujące polisacharydy stanowią podstawę dla ważnej klasy selektorów chiralnych.
Chemia
Amylozy i celulozy nie można stosować jako takich ze względu na słabą rozdzielczość i trudności w posługiwaniu się nimi. Jednak pochodne karbaminianowe i benzoesanowe tych polimerów, zwłaszcza amylozy i celulozy, wykazują doskonałe właściwości jako selektory chiralne do rozdziału chromatograficznego. Duża liczba CSP na bazie polisacharydów jest dostępna w handlu do rozdzielania chiralnego. Te CSP wykazały ogromną zdolność rozpoznawania chiralnego w celu rozwiązania szerokiej gamy analitów chiralnych. Wiele z tych CSP zostało wprowadzonych na rynek przez firmę Daicel Chemical Industries, Ltd., a niektóre z popularnych wymieniono w tabeli.
| # | Adsorbent / opis fazy stacjonarnej | Chiralna faza stacjonarna (nazwa handlowa) |
| 1. | Tris-(3,5-dimetylofenylokarbaminian) celulozy | Chiralcel OD® ( Daicel) |
| 2. | Tris-(4-metylobenzoesan) celulozy | Chiralcel OJ® / Lux® Celuloza-3 (Phenomenex) |
| 3. | Tris(3,5-dimetylofenylokarbaminian amylozy) | Chiralpak AD® ( Daicel) |
| 4. | Karbaminian tris(S)-a-metylobenzylu amylozy | Chiralpak AS® ( Daicel) |
| 5. | Tris(3-chloro-4-metylofenylokarbaminian) celulozy | Chiralcel OZ® ( Daicel) |
| 6. | Tris(5-chloro-2-metylofenylokarbaminian amylozy) | Chiralcel AY® ( Daicel) |
| 7. | Tris(3-chloro-4-metylofenylokarbaminian amylozy) | Chirlpak AZ ® (Daicel) |
| 8. | Tris(4-chloro-3-metylofenylokarbaminian) celulozy | Chiralcel OX ® (Daicel) |
| 9. | selektor tris(3,5-dimetylofenylo)karbamoilocelulozy | RegisCell® |
| 10. | selektor tris(3,5-dimetylofenylo)karbamoiloamylozy | RegisPack® |
Te CSP są kompatybilne z NP/RP i SFC, a także używane do rozdziałów analitycznych, półpreparatywnych i preparatywnych. Wiele badań przesiewowych przeprowadzonych w różnych laboratoriach sugeruje, że cztery CSP, a mianowicie Chiralcel OD, Chiralcel OJ, Chiralpak AD i Chiralpak As, są w stanie rozwiązać ponad 80% chiralnych separacji ze względu na ich zdolność adaptacji i wysoką ładowność. Te cztery polisacharydowe chiralne stacjonarne fazy stacjonarne są określane jako „złota czwórka”.
Polisacharydowe CSP są przygotowywane z wysokiej jakości nośnikiem krzemionkowym, na którym polimerowy selektor chiralny (dr amyloza/celuloza) jest powlekany fizycznie (powlekany CSP) lub unieruchamiany chemicznie (immobilizowany CSP). Separacje można przeprowadzać w trybie normalnej fazy, odwróconej fazy i polarnego trybu organicznego. Podczas pracy z powlekanym polisacharydem CSP należy ostrożnie dobierać rozpuszczalniki. Nie należy stosować drastycznych rozpuszczalników, takich jak dichlorometan, chloroform, toluen, octan etylu, THF; 1,4-dioksan; aceton; DMSO itp. Te tak zwane „niestandardowe” rozpuszczalniki rozpuszczają krzemionkę i nieodwracalnie niszczą fazę stacjonarną. Ograniczona odporność tych powlekanych faz na wiele rozpuszczalników prowadzi do rozwoju immobilizowanego polisacharydu CSP. Poniższa tabela przedstawia niektóre z immobilizowanych CSP dostępnych na rynku oraz ich zamienniki, jeśli są dostępne.
| # | Selektor chiralny/chemia adsorbentów | Chiralna faza stacjonarna/ Dostawcy | ||
|---|---|---|---|---|
| Daicel® _ | Fenomenex® _ | Reprosil ® | ||
| 1 | Tris(3,5-dimetylofenylo)karbaminian amylozy (jak w Chiralpak® AD) | Chiralpak® IA _ | Lux® i-amyloza-1 | Reprosil® MIA _ |
| 2 | Tris(3,5-dimetylofenylo)karbaminian celulozy (jak w Chiralcel® OD) | Chiralcel® IB _ | ----- | Reprosil® MIB _ |
| 3 | Tris(3,5-dichlorofenylo)karbaminian celulozy | Chiralcel® IC _ | Lux® i-celuloza-5 | Reprosil® MIC _ |
| 4 | Tris(3-chlorofenylo)karbaminian amylozy | Identyfikator Chiralpak® _ | ----- | ----- |
| 5 | Tris(3,5-dichlorofenylo)karbaminian amylozy | Chiralpak® IE _ | ----- | ----- |
| 6 | Tris(3-chloro,4-metylofenylo)karbaminian amylozy | Chiralpak® IF _ | ----- | ----- |
| 7 | Tris(3-chloro,5-metylofenylo)karbaminian amylozy | Chiralpak® IG _ | ----- | ----- |
Te unieruchomione CSP są znacznie bardziej wytrzymałe i można zastosować „niestandardowe” rozpuszczalniki. Poszerzając w ten sposób wybór współrozpuszczalnika. Główną zaletą unieruchomionych CSP jest duża wszechstronność rozpuszczalnika w doborze składu fazy ruchomej, zwiększona rozpuszczalność próbki, wysoka selektywność, solidność i wydłużona trwałość, doskonała wydajność kolumny i szeroka dziedzina zastosowań w rozdzielaniu enancjomerów. Rozpuszczalnik jest kluczowym czynnikiem w HPLC MD. Więcej rozpuszczalników do zabawy oznacza lepszą rozpuszczalność próbki, poprawia rozdzielczość i umożliwia efektywny rozwój metody chiralnej.
Mechanizm
W polimerze tworzy się wiele środowisk chiralnych. Między sąsiednimi jednostkami glukozy powstają wgłębienia, a między łańcuchami polisacharydowymi powstają przestrzenie/kanały. Te chiralne wnęki lub kanały dają chiralną zdolność rozróżniania polisacharydowych CSP. Mechanizm rozróżniania chiralnego nie jest dobrze poznany, ale uważa się, że obejmuje wiązanie wodorowe i interakcję dipol-dipol między cząsteczką analitu a wiązaniem estrowym lub karbaminianowym CSP.
Aplikacja
Niektóre z zastosowań tych CSP obejmują bezpośrednią analizę chiralną blokerów β-adrenergicznych, takich jak metoprolol i celiprolol, bloker kanału wapniowego, felodypina i środek przeciwdrgawkowy, etotoina.
Makrocykliczne CSP
Interesującym sposobem osiągnięcia chiralnego rozróżnienia na CSP jest użycie selektorów z chiralną wnęką. Te selektory chiralne są przyłączone do materiału nośnika fazy stacjonarnej. W tej kategorii istnieją zasadniczo trzy rodzaje chiralnych selektorów wnękowych, a mianowicie cyklodekstryny, etery koronowe i makrocykliczne antybiotyki glikopeptydowe. Wśród nich popularny jest CSP na bazie cyklodekstryny. W tego typu CSP enancjoselektywna interakcja gość-gospodarz reguluje chiralne rozróżnienie.
CSP typu cyklodekstryny
Cyklodekstryny (CD) są cyklicznymi oligosacharydami składającymi się z sześciu, siedmiu lub ośmiu jednostek glukozy, oznaczonych odpowiednio jako cyklodekstryny α, β i γ. Przedstawione na poniższym schemacie. Daniel Armstrong jest uważany za pioniera rozdziałów opartych na micelach i cyklodekstrynach. Cyklodekstryny są kowalencyjnie przyłączane do krzemionki w procesie Armstronga i zapewniają stabilne CSP. Pierwszorzędowe grupy hydroksylowe służą do zakotwiczenia cząsteczek CD na zmodyfikowanej powierzchni krzemionki. CD są chiralne z powodu wrodzonej chiralności bloków budulcowych, jednostek glukozy. W cyklodekstrynie jednostki glukozy są połączone α-(1,4)-. Kształt CD przypomina skrócony stożek (patrz szkic). Wewnętrzna powierzchnia stożka tworzy umiarkowanie hydrofobową kieszeń. Szerokość wnęki CD jest identyfikowana z ilością obecnych jednostek glukozy. W cyklodekstrynach drugorzędowe grupy hydroksylowe (OH-2 i -3) wyścielają górną krawędź wnęki, a zasadnicza grupa 6-hydroksylowa jest umieszczona na dolnej krawędzi. Grupa hydroksylowa oferuje chiralne punkty wiązania, które wydają się być fundamentalne dla enancjoselektywności. Apolarny tlen gliozydowy nadaje pitowi hydrofobowość i gwarantuje kompleksowanie inkluzyjne części hydrofobowej analitów. Oddziaływania pomiędzy obszarem polarnym analitu i drugorzędowymi grupami hydroksylowymi u wylotu wgłębienia, połączone z połączeniami hydrofobowymi wewnątrz wgłębienia, dają unikalne dopasowanie dwupunktowe i prowadzą do enancjoselektywności.
Selektywność fazy cyklodekstrynowej zależy od dwóch kluczowych czynników, a mianowicie wielkości i struktury analitu, ponieważ opiera się na prostym kryterium geometrycznym dopasowanie-niedopasowanie. Pierścień aromatyczny lub pierścień cykloalkilowy powinien być przyłączony w pobliżu centrum stereogenicznego analitu. Podstawniki na lub w pobliżu centrum chiralności analitu muszą być w stanie oddziaływać z grupami hydroksylowymi przy wejściu do wnęki CD poprzez wiązanie H. α-cyklodekstryna zawiera małe cząsteczki aromatyczne, podczas gdy β-cyklodekstryna zawiera zarówno grupy naftylowe, jak i podstawione grupy fenylowe. Wodna kompatybilność CD i jego unikalna struktura molekularna sprawiają, że faza związana z CD jest wysoce odpowiednia do stosowania w chiralnej analizie leków metodą HPLC. Kolejną zaletą CD jest to, że są generalnie tańsze niż inne CSP. Niektóre z głównych wad CD CSP są ograniczone do związków, które mogą dostać się do jamy CD, drobne zmiany strukturalne w analicie prowadzą do nieprzewidywalnego wpływu na rozdzielczość, często słabą wydajność i nie mogą odwrócić kolejności elucji.
Enancjomery propranololu, metoprololu, chlorfeniraminy, werapamilu, heksobarbitalu, metadonu i wielu innych leków zostały rozdzielone za pomocą immobilizowanej β-cyklodekstryny.
Początkowo jako selektor chiralny stosowano naturalne CD. Później przygotowano zmodyfikowane struktury cyklodekstryn przez derywatyzację drugorzędowych grup hydroksylowych obecnych w cząsteczce CD. Włączenie tych dodatkowych grup funkcyjnych może poprawić zdolność rozpoznawania chiralnego przez ewentualną modyfikację kieszeni chiralnej i utworzenie dodatkowego pomocniczego miejsca interakcji. Takie podejście umożliwiło rozszerzenie zakresu docelowych analitów chiralnych, które można było rozdzielić. Wiele chiralnych farmaceutyków zostało rozwiązanych przy użyciu derywatyzowanych CD, w tym ibuprofenu, suprofenu, flurbiprofenu z kategorii NLPZ oraz b-blokerów, takich jak metoprolol i atenolol. Krótka lista dostępnych na rynku chiralnych stacjonarnych faz stacjonarnych opartych na cyklodekstrynie znajduje się w poniższej tabeli.
| Chiralna faza stacjonarna (nazwa handlowa) | Selektor chiralny/opis chemiczny | Tryb # | Firma/główny dystrybutor |
| Cykloobligacja® I 2000 | Naturalna β-cyklodekstryna | RP, PO | Advanced Separation Technology (Astec), Whippany, NJ |
| Cyklowiązanie ® II | Naturalna γ-cyklodekstryna | RP, PO | Astec |
| Cyklowiązanie ® III | Naturalna α-cyklodekstryna | RP, PO | Astec |
| Cyclobond® I 2000 AC | Acetylowana β-cyklodekstryna | RP, PO | Astec |
| Cyclobond® I 2000 SP | (S)-hydroksypropylo-β-cyklodekstryna | RP, PO | Astec |
| Cyclobond® I 2000 SN | (S)-1(1-naftylo)etylokarbamoilo-β-cyklodekstryna | RP, NP, PO | Astec |
| Cyclobond® I 2000 RN | (R)-1(1-naftylo)etylokarbamoilo-β-cyklodekstryna | RP, NP, PO | Astec |
| Cyclobond® I 2000 DMP | 3,5-dimetylofenylokarbamoilo-β-cyklodekstryna | RP, NP, PO | Astec |
| Cyclobond ® II AC | Acetylowana γ-cyklodekstryna | RP, PO | Astec |
| Cyclobond ® III AC | Acetylowana α-cyklodekstryna | RP, PO | Astec |
| ChiraDex® _ | Natywna α-cyklodekstryna | RP, PO | Merck, Niemcy |
| ChiraDex® Gamma _ | Natywna γ-cyklodekstryna | RP, PO | Merck |
| Uwaga: # RP, odwrócona faza; PO, polarna organiczna; NP, faza normalna. | |||
CSP typu glikopeptydowego
Armstrong wprowadził glikopeptydy makrocykliczne (znane również jako antybiotyki glikopeptydowe ) jako nową klasę selektorów chiralnych do chromatografii cieczowej w 1994 roku. Obecnie wankomycyna , teikoplanina i rystocetyna są dostępne odpowiednio pod nazwami handlowymi Chirobiotic V, Chirobiotic T i Chirobiotic R. Te cykliczne glikopeptydy mają wiele centrów chiralności i podobny do miseczki obszar wtrąceń, do którego przymocowana jest pływająca pokrywka cukrowa. Podobnie jak chiralne selektory białek, amfoteryczne cykliczne glikopeptydy składają się z miejsc wiązania peptydów i węglowodanów, co prowadzi do możliwości różnych sposobów interakcji poza tworzeniem kompleksów inkluzyjnych. W tym selektorze chiralnym wnęki są płytsze niż w przypadku płyt CD, a zatem interakcje są słabsze, co umożliwia szybszą wymianę substancji rozpuszczonej między fazami, wyższą wydajność kolumny. działa w fazie normalnej, fazie odwróconej i polarnej fazie organicznej.
Złożona strukturalna natura glikopeptydowej klasy antybiotyków CSP sprawiła, że zrozumienie mechanizmu rozpoznawania chiralnego na poziomie molekularnym jest trudne. Na przykład cząsteczka wankomycyny ma 18 centrów stereogenicznych w cząsteczce i oferuje złożone chiralne środowisko podobne do cyklodekstryny. W porównaniu do pojedynczego koszyka cyklodekstryn, wankomycyna składa się z trzech koszyków, co skutkuje bardziej złożonym włączeniem odpowiednich cząsteczek gościa. Siły przyciągania obejmują oddziaływania π-π, wiązania wodorowe, oddziaływania jonowe i układanie dipoli. Kwas karboksylowy i drugorzędowa grupa aminowa znajdują się na obrzeżu kubka i mogą uczestniczyć w oddziaływaniach jonowych. Fazy stacjonarne wankomycyny działają w trybach odwróconej, normalnej i polarnej fazy organicznej.
Przeprowadzono szeroki zakres analiz chiralnych przy użyciu chirobiotycznych CSP. Leki przeciwnadciśnieniowe tj. oksprenolol, pindolol, propranolol zostały rozdzielone za pomocą chirobiotyku CSPS wankomycyny i teikoplaniny. Leki NLPZ, ketoprofen i ibuprofen, zostały oddzielone za pomocą rystocetyny CSP.
CSP typu eteru koronowego
Etery koronowe , podobnie jak CSP typu cyklodekstryny, zawierają wnękę chiralną. Etery koronowe są immobilizowane na powierzchni krzemionki, tworząc chiralną fazę stacjonarną. Etery koronowe zawierają atomy tlenu we wnęce. Cykliczna struktura, która zawiera niepolarne grupy etylenowe między tlenem, tworzy hydrofobową wnękę wewnętrzną. Cram i wsp . wprowadzili CSP na bazie chiralnych eterów koronowych i dokonali rozdziału aminokwasów. Kluczowa zasada rozpoznawania chiralnego leżąca u podstaw rozdziału enancjomerów na bazie eteru koronowego opiera się na tworzeniu licznych wiązań wodorowych między protonowaną pierwszorzędową grupą aminową analitu a tlenami eterowymi struktury korony. To wymaganie strukturalne ogranicza zastosowanie CSP typu eteru koronowego do związków chiralnych zawierających pierwszorzędowe grupy aminowe przylegające do centrów chiralnych, takich jak aminokwasy, pochodne aminokwasów. Dokonano przeglądu postępów w dziedzinie CSP typu eteru koronowego.
CSP typu białkowego
Białka to złożone biopolimery o dużej masie cząsteczkowej. Są z natury chiralne, składają się z L-aminokwasów i mają uporządkowaną strukturę 3D. Wiadomo, że odwracalnie wiążą / oddziałują stereoselektywnie z małymi cząsteczkami, co czyni je niezwykle wszechstronnymi CSP do chiralnego rozdzielania cząsteczek leków. Hermansson wykorzystał tę właściwość do opracowania szeregu CSP poprzez unieruchomienie białek na powierzchni krzemionki. Działają w trybie odwróconej fazy (bufor fosforanowy i modyfikatory organiczne).
Polimer białkowy pozostaje w postaci skręconej ze względu na różne wiązania wewnątrzcząsteczkowe. Wiązania te tworzą różnego rodzaju chiralne pętle/rowki obecne w cząsteczce białka. Mechanizm separacji białek polega na unikalnej kombinacji oddziaływań hydrofobowych i polarnych, dzięki którym anality są orientowane na powierzchniach chiralnych. Wiązanie H i transfer ładunku mogą również przyczyniać się do enancjoselektywności. Mechanizm rozróżniania chiralnego przez białka nie jest w większości dobrze poznany ze względu na ich złożoną naturę. Do chiralnej analizy leków zastosowano kilka CSP opartych na białkach, w tym glikoproteinę α-kwaśną (enancjomer; chiral-AGP), białko jajowodu (Ultron ES DVM), albuminę surowicy ludzkiej (HSA). α-AGP CSP (chiralny AGP) zastosowano do ilościowego oznaczania enancjomerów atenololu w matrycach biologicznych, do badań farmakokinetycznych racemicznego metoprololu. Główną słabością CSP opartych na białkach jest niska ładowność, fazy białkowe są drogie, wyjątkowo delikatne, delikatne w obsłudze, bardzo niska wydajność kolumny, nie można odwrócić kolejności elucji.
CSP typu Pirkle'a
Pirkle i współpracownicy byli pionierami w opracowywaniu różnych CSP opartych na kompleksowaniu z przeniesieniem ładunku i jednoczesnym wiązaniu wodorowym. Fazy te są również określane jako CSP typu szczotkowego. Fazy Pirkle'a oparte są na aromatycznej pochodnej π-kwasu (pierścień 3,5-dinitrobenzoilu) i π-zasady (naftalenu). Oprócz miejsc interakcji π-π, mają miejsca wiązań wodorowych i miejsc interakcji dipol-dipol, które zapewniają funkcje amidowe, mocznikowe lub estrowe. Silna trójpunktowa interakcja, zgodnie z modelem Dalgleisha, umożliwia enancjoseparację. Fazy te dzielą się na π-akceptor elektronów, π-donor elektronów lub π-akceptor-donor elektronów.
W handlu dostępnych jest wiele CSP typu Pirkle'a. Stosowane są najczęściej w normalnym trybie fazowym. Postać jonowa CSP DNPBG (3,5-dinitrobenzoilo-fenyloglicyny) została z powodzeniem zastosowana do wydzielenia racemicznego propranololu w płynie biologicznym. Wiele związków o znaczeniu farmaceutycznym, w tym enancjomery naproksenu i metoprololu, zostało rozdzielonych przy użyciu Pirkle CSP.
Nowe selektory chiralne i CSP
W ciągu ostatnich kilku lat nastąpił rozwój CSP opartych na nowych selektorach chiralnych, a mianowicie. pochodne chitozanu, pochodne cylofruktanu i chiralne materiały porowate do chiralnego rozdziału metodą HPLC.
CSP na bazie pochodnych chitozanu
CSP na bazie pochodnych cyklofruktanu
CSP na bazie chiralnych materiałów porowatych
Zobacz też
- Rozdzielczość chiralna
- Chromatografia chiralna
- Leki chiralne
- Przełącznik chiralny
- enancjomer
- Chiralność