Analiza strumienia metabolicznego

Analiza przepływu metabolicznego (MFA) to eksperymentalna technika fluksomiki stosowana do badania tempa produkcji i zużycia metabolitów w systemie biologicznym. Na poziomie wewnątrzkomórkowym pozwala na ilościową ocenę strumieni metabolicznych , wyjaśniając w ten sposób centralny metabolizm komórki. Różne metody MFA, w tym izotopowo stacjonarna analiza strumienia metabolicznego, izotopowo niestacjonarna analiza strumienia metabolicznego i analiza strumienia metabolicznego oparta na termodynamice, można łączyć ze stechiometrycznymi modelami metabolizmu i spektrometrii mas z rozdzielczością mas izotopowych w celu wyjaśnienia przenoszenia ugrupowań zawierających znaczniki izotopowe z jednego metabolitu do drugiego i uzyskania informacji o sieci metabolicznej. Analiza przepływu metabolicznego (MFA) ma wiele zastosowań, takich jak określanie ograniczeń zdolności systemu biologicznego do wytwarzania substancji biochemicznych, takich jak etanol , przewidywanie odpowiedzi na nokaut genu oraz kierowanie identyfikacją enzymów wąskich gardeł w sieciach metabolicznych na potrzeby inżynierii metabolicznej .

Przykład mapy strumieni metabolicznych dla szlaków metabolicznych astrocytów i neuronów.

Analiza przepływu metabolicznego może wykorzystywać znaczniki izotopowe znakowane ^13C do eksperymentów ze znakowaniem izotopowym . Techniki magnetycznego rezonansu jądrowego ( NMR ) i spektrometrię mas można następnie wykorzystać do pomiaru wzorców znakowania metabolitów w celu dostarczenia informacji do określenia strumieni szlaku. Ponieważ MFA zwykle wymaga rygorystycznego obliczania strumienia złożonych sieci metabolicznych, opracowano publicznie dostępne narzędzia programowe w celu zautomatyzowania MFA i zmniejszenia obciążenia obliczeniowego.

Metoda eksperymentalna

Chociaż użycie równowagi stechiometrycznej i ograniczeń metabolitów składających się na sieć metaboliczną może wyjaśnić przepływy, podejście to ma ograniczenia, w tym trudności w stymulowaniu przepływów przez równoległe, cykliczne i odwracalne ścieżki. Co więcej, istnieje ograniczony wgląd w to, w jaki sposób metabolity wzajemnie się przekształcają w sieci metabolicznej bez użycia znaczników izotopowych. W ten sposób stosowanie izotopów stało się dominującą techniką MFA.

Eksperymenty ze znakowaniem izotopowym

Uproszczony przebieg przykładowego eksperymentu znakowania izotopów. Czarne kółko na znaczniku glukozy reprezentuje znakowany atom węgla, podczas gdy niebieskie atomy reprezentują nieoznaczony atom węgla.

Eksperymenty ze znakowaniem izotopowym są optymalne do gromadzenia danych eksperymentalnych niezbędnych do MFA. Ponieważ strumienie określają wzorce znakowania izotopowego metabolitów wewnątrzkomórkowych, pomiar tych wzorców pozwala na wnioskowanie o przepływach. Pierwszym krokiem w przepływie pracy eksperymentów ze znakowaniem izotopowym jest hodowla komórek na znakowanych substratach. Substrat, taki jak glukoza, jest znakowany izotopem (izotopami), najczęściej ¹³ C i jest wprowadzany do pożywki hodowlanej. Pożywka zazwyczaj zawiera również witaminy i niezbędne aminokwasy ułatwiające wzrost komórek. Znakowany substrat jest następnie metabolizowany przez komórki, co prowadzi do włączenia ¹³ Znacznik C w innych metabolitach wewnątrzkomórkowych. Gdy komórki osiągną stan fizjologiczny stanu ustalonego (tj. stałe stężenie metabolitów w hodowli), komórki poddaje się następnie lizie w celu ekstrakcji metabolitów. W przypadku komórek ssaków ekstrakcja obejmuje hartowanie komórek przy użyciu metanolu w celu zatrzymania ich metabolizmu komórkowego, a następnie ekstrakcję metabolitów przy użyciu metanolu i ekstrakcji wodnej. Stężenia metabolitów i znakowanych izotopów w metabolitach ekstraktów są mierzone za pomocą przyrządów takich jak chromatografia cieczowa-spektrometria mas lub NMR, które również dostarczają informacji o położeniu i liczbie znakowanych atomów metabolitów. Dane te są niezbędne do uzyskania wglądu w dynamikę metabolizmu wewnątrzkomórkowego i szybkości obrotu metabolitów w celu wywnioskowania przepływu metabolicznego.

Metodologie

Izotopowo stacjonarne

Dominującą metodą analizy strumienia metabolicznego jest izotopowo stacjonarny MFA. Ta technika oznaczania ilościowego strumienia ma zastosowanie w metabolicznym i izotopowym stanie stacjonarnym, dwóch warunkach, które zakładają, że odpowiednio stężenia metabolitów i izotopomerów nie zmieniają się w czasie. Znajomość macierzy stechiometrycznej (S) obejmującej konsumpcję i produkcję metabolitów w reakcjach biochemicznych jest niezbędna do zbilansowania strumieni (v) wokół założonego modelu sieci metabolicznej. Zakładając metaboliczny stan stacjonarny, strumienie metaboliczne można zatem określić ilościowo, rozwiązując odwrotność następującej prostej algebry liniowej równanie:

${\ displaystyle S \ razy v = 0}$

Aby zmniejszyć możliwą przestrzeń rozwiązań dla rozkładów strumieni, izotopowo stacjonarny MFA wymaga dodatkowych ograniczeń stechiometrycznych, takich jak tempo wzrostu, wydzielanie i pobieranie substratu oraz szybkości gromadzenia się produktu, a także górne i dolne granice dla strumieni. Chociaż izotopowo stacjonarny MFA pozwala na precyzyjne wydedukowanie przepływów metabolicznych poprzez modelowanie matematyczne, analiza ogranicza się do hodowli okresowych podczas fazy wykładniczej. Ponadto, po dodaniu znakowanego substratu, trudno jest określić punkt czasowy, w którym można dokładnie założyć metaboliczny i izotopowy stan stacjonarny.

Izotopowo niestacjonarne

Gdy znakowanie izotopowe jest przejściowe i jeszcze się nie wyrównało, izotopowo niestacjonarny MFA (INST-MFA) jest korzystny w określaniu strumieni, szczególnie w przypadku systemów o powolnej dynamice znakowania. Podobnie jak izotopowo stacjonarny MFA, ta metoda wymaga bilansu masy i izotopomerów, aby scharakteryzować stechiometrię i przejścia atomowe sieci metabolicznej. Jednak w przeciwieństwie do tradycyjnych metod MFA, INST-MFA wymaga zastosowania zwykłych równań różniczkowych w celu zbadania, jak wzorce znakowania izotopowego metabolitów zmieniają się w czasie; takie badanie można przeprowadzić, mierząc zmieniające się wzorce znakowania izotopowego w różnych punktach czasowych, aby wprowadzić je do INST-MFA. INST-MFA jest zatem potężną metodą wyjaśniania przepływów systemów z wąskimi gardłami szlaków i ujawniania metabolicznych fenotypy organizmów autotroficznych . Chociaż intensywne wymagania obliczeniowe INST-MFA wcześniej utrudniały jego powszechne stosowanie, nowo opracowane narzędzia programowe usprawniły INST-MFA, aby skrócić czas obliczeń i zmniejszyć zapotrzebowanie.

Oparte na termodynamice

Analiza strumienia metabolicznego oparta na termodynamice (TMFA) to wyspecjalizowany rodzaj analizy strumienia metabolicznego, który wykorzystuje liniowe ograniczenia termodynamiczne oprócz ograniczeń bilansu masy w celu wygenerowania termodynamicznie wykonalnych strumieni i profili aktywności metabolitów. TMFA bierze pod uwagę tylko ścieżki i strumienie, które są możliwe przy użyciu darmowej energii Gibbsa zmiana reakcji i aktywności metabolitów wchodzących w skład modelu. Obliczając energię swobodną Gibbsa reakcji metabolicznych, a co za tym idzie ich korzystną termodynamikę, TMFA ułatwia identyfikację ograniczających reakcji wąskich gardeł szlaku, które mogą być idealnymi kandydatami do regulacji szlaku.

Oprogramowanie

Algorytmy symulacyjne są potrzebne do modelowania systemu biologicznego i obliczania strumieni wszystkich ścieżek w złożonej sieci. Istnieje kilka programów obliczeniowych, które zaspokajają zapotrzebowanie na wydajne i precyzyjne narzędzia do ilościowego oznaczania strumienia. Ogólnie rzecz biorąc, etapy zastosowania oprogramowania do modelowania w kierunku MFA obejmują rekonstrukcję metaboliczną w celu skompilowania wszystkich pożądanych reakcji enzymatycznych i metabolitów, dostarczenie informacji eksperymentalnych, takich jak wzór znakowania substratu, zdefiniowanie ograniczeń, takich jak równania wzrostu, oraz zminimalizowanie błędu między eksperymentalnym a symulowanym wyników w celu uzyskania strumieni końcowych. Przykłady oprogramowania MFA obejmują 13CFLUX2 i OpenFLUX, które oceniają ¹³ C do obliczania strumienia w warunkach metabolicznych i izotopowych. Rosnące zainteresowanie opracowywaniem narzędzi obliczeniowych do obliczeń INST-MFA doprowadziło również do rozwoju aplikacji, takich jak INCA, które było pierwszym oprogramowaniem zdolnym do przeprowadzania INST-MFA i symulowania przejściowych eksperymentów znakowania izotopów.

Aplikacje

Produkcja biopaliw

Analiza strumienia metabolicznego została wykorzystana do ukierunkowania wysiłków na rzecz zwiększenia skali fermentacji biopaliw. Poprzez bezpośredni pomiar szybkości reakcji enzymatycznych, MFA może uchwycić dynamikę zachowania komórek i fenotypy metaboliczne w bioreaktorach podczas fermentacji na dużą skalę. Na przykład modele MFA wykorzystano do optymalizacji konwersji ksylozy do etanolu w drożdżach fermentujących ksylozę za pomocą obliczonych rozkładów strumienia w celu określenia maksymalnych teoretycznych zdolności wybranych drożdży do produkcji etanolu.

Inżynieria metaboliczna

Identyfikacja enzymów wąskich gardeł określa reakcje ograniczające szybkość, które ograniczają produktywność szlaku biosyntezy. Co więcej, MFA może pomóc w przewidywaniu nieoczekiwanych fenotypów genetycznie zmodyfikowanych szczepów poprzez konstruowanie fundamentalnej wiedzy na temat sposobu, w jaki strumienie są połączone w zmodyfikowanych komórkach. Na przykład, obliczając energię swobodną Gibbsa reakcji w Escherichia coli , TMFA ułatwiło identyfikację termodynamicznej reakcji wąskiego gardła w modelu Escherichia coli w skali genomu.

Zobacz też