Bezkomórkowa macierz białkowa
bezkomórkowych macierzy białkowych umożliwia wytwarzanie mikromacierzy białkowych poprzez przeprowadzanie syntezy in vitro docelowych białek z ich szablonów DNA . Ta metoda syntezy mikromacierzy białkowych pokonuje wiele przeszkód i wyzwań stojących przed tradycyjnymi metodami produkcji macierzy białkowych, które uniemożliwiły szerokie zastosowanie mikromacierzy białkowych w proteomice . Macierze białkowe wykonane w tej technologii mogą być wykorzystywane do testowania interakcji białko-białko , a także interakcji białek z innymi cząsteczkami komórkowymi, takimi jak DNA i lipidy. Inne zastosowania obejmują testy hamowania enzymatycznego i badania przesiewowe specyficzności przeciwciał.
Przegląd i tło
Niespodziewany sukces mikromacierzy DNA wywołał wiele entuzjazmu dla mikromacierzy białkowych. Jednak mikromacierze białkowe nie rozwinęły się tak, jak oczekiwano, nawet jeśli niezbędne narzędzia i wiedza specjalistyczna z mikromacierzy DNA są gotowe do adaptacji. Jednym z głównych powodów jest to, że mikromacierze białkowe są znacznie bardziej pracochłonne i technicznie trudniejsze do skonstruowania niż mikromacierze DNA.
Tradycyjne metody wytwarzania macierzy białkowych wymagają oddzielnej ekspresji in vivo setek lub tysięcy białek, a następnie odrębnego oczyszczania i immobilizacji białek na powierzchni ciała stałego. Technologia bezkomórkowych macierzy białkowych ma na celu uproszczenie konstrukcji mikromacierzy białkowych poprzez pominięcie konieczności ekspresji białek w komórkach bakteryjnych i wynikającej z tego konieczności ich oczyszczania. Wykorzystuje dostępną bezkomórkowej syntezy białek , która wykazała, że synteza białek może zachodzić bez nienaruszonej komórki, o ile dostarczane są ekstrakty komórkowe zawierające matrycę DNA, surowce do transkrypcji i translacji oraz maszynerię. Typowe źródła ekstraktów komórkowych stosowanych w technologii bezkomórkowych macierzy białkowych obejmują kiełki pszenicy , Escherichia coli i retikulocyty królika . Stosowano również ekstrakty komórkowe z innych źródeł, takich jak hipertermofile , hybrydomy , oocyty Xenopus , komórki owadów, ssaków i ludzi.
Białka docelowe są syntetyzowane in situ na mikromacierzy białkowej, bezpośrednio z matrycy DNA, pomijając w ten sposób wiele etapów tradycyjnej produkcji mikromacierzy białkowych i towarzyszące im ograniczenia techniczne. Co ważniejsze, ekspresję białek można przeprowadzić równolegle, co oznacza, że wszystkie białka mogą być wyrażane razem w jednej reakcji. Ta zdolność do multipleksowania ekspresji białek jest główną oszczędnością czasu w procesie produkcyjnym.
Metody syntezy
Metody in situ
W metodzie in situ syntezę białek przeprowadza się na powierzchni macierzy białkowej, która jest wstępnie pokryta odczynnikiem wychwytującym białko lub przeciwciałem . Gdy nowo zsyntetyzowane białka zostaną uwolnione z rybosomu , sekwencja znacznika , która jest również syntetyzowana na końcu N lub C każdego powstającego białka, zostanie związana przez odczynnik wychwytujący lub przeciwciało, unieruchamiając w ten sposób białka, tworząc macierz. Powszechnie stosowane znaczniki obejmują polihistydynę (His)6 i s-transferazę glutationu (GST).
Różne grupy badawcze opracowały własne metody, z których każda różni się podejściem, ale można je podsumować w 3 główne grupy.
Programowalna macierz białkowa kwasu nukleinowego (NAPPA)
NAPPA wykorzystuje szablon DNA, który został już unieruchomiony na tej samej powierzchni wychwytującej białko. Matryca DNA jest biotynylowana i związana z awidyną , która jest wstępnie pokryta powierzchnią wychwytującą białko. Nowo zsyntetyzowane białka, które są znakowane GST, są następnie unieruchamiane obok matrycowego DNA przez wiązanie z sąsiednim poliklonalnym przeciwciałem wychwytującym anty-GST, które jest również wstępnie powlekane na powierzchni wychwytującej. wadą tej metody są dodatkowe i żmudne etapy przygotowania na początku procesu: (1) klonowanie cDNA w wektorze gotowym do ekspresji ; oraz (2) konieczność biotynylowania plazmidowego DNA, ale bez zakłócania transkrypcji. Co więcej, otrzymana macierz białkowa nie jest „czysta”, ponieważ białka są zlokalizowane razem z ich matrycami DNA i przeciwciałami wychwytującymi.
białek in situ (PISA)
W przeciwieństwie do NAPPA, PISA całkowicie omija immobilizację DNA, ponieważ matryca DNA jest dodawana jako wolna cząsteczka do mieszaniny reakcyjnej. W 2006 roku inna grupa udoskonaliła i zminiaturyzowała tę metodę, stosując technikę wielokrotnego nakrapiania w celu wykrycia matrycy DNA oraz bezkomórkowej mieszaniny transkrypcji i translacji na mikromacierzy białkowej o dużej gęstości zawierającej do 13 000 plamek. Było to możliwe dzięki zautomatyzowanemu systemowi stosowanemu do dokładnego i sekwencyjnego dostarczania odczynników do reakcji transkrypcji/translacji zachodzącej w małej, poniżej nanolitrowej kropli.
Wychwytywanie puromycyny in situ
Ta metoda jest adaptacją technologii prezentacji mRNA . DNA PCR jest najpierw transkrybowane do mRNA , a jednoniciowy oligonukleotyd DNA zmodyfikowany na każdym końcu biotyną i puromycyną jest następnie hybrydyzowany z końcem 3' mRNA. Następnie mRNA są układane na szkiełku i unieruchamiane przez wiązanie biotyny ze streptawidyną , która jest wstępnie powlekana na szkiełku. Ekstrakt komórkowy jest następnie dozowany na szkiełko w celu zajścia translacji in situ . Kiedy rybosom dociera do zhybrydyzowanego oligonukleotydu, zatrzymuje się i włącza cząsteczkę puromycyny do powstającego łańcucha polipeptydowego , przyłączając w ten sposób nowo zsyntetyzowane białko do mikromacierzy za pośrednictwem oligonukleotydu DNA. Macierz czystych białek otrzymuje się po trawieniu mRNA RNazą . Plamy białkowe generowane tą metodą są bardzo ostro zarysowane i mogą być wytwarzane z dużą gęstością.
Format macierzy nanodołków
Formaty macierzy Nanowell są używane do ekspresji poszczególnych białek w naczyniach reakcyjnych o małej objętości lub nanostudzienkach (Rysunek 4). Ten format jest czasami preferowany, ponieważ pozwala uniknąć konieczności unieruchamiania białka docelowego, co mogłoby skutkować potencjalną utratą aktywności białka. Miniaturyzacja macierzy oszczędza również roztwór i cenne związki, które można wykorzystać w testach przesiewowych. Ponadto właściwości strukturalne poszczególnych studzienek pomagają zapobiegać zanieczyszczeniu krzyżowemu między komorami. W 2012 roku opublikowano ulepszoną NAPPA, w której zastosowano układ nanostudzienek, aby zapobiec dyfuzji. Tutaj DNA unieruchomiono w studzience wraz z przeciwciałem anty-GST. Następnie dodano wolną od komórek mieszaninę ekspresyjną i studzienki zamknięto pokrywką. Powstające białka zawierające znacznik GST były związane z powierzchnią studzienki, umożliwiając uzyskanie macierzy NAPPA o większej gęstości i prawie bez zanieczyszczeń krzyżowych.
Macierz DNA do macierzy białkowej (DAPA)
Macierz DNA do macierzy białkowej (DAPA) to metoda opracowana w 2007 r. w celu wielokrotnego wytwarzania macierzy białkowych poprzez „drukowanie” ich z pojedynczej macierzy matrycowej DNA na żądanie (Rysunek 5). Rozpoczyna się od naniesienia plam i unieruchomienia szeregu szablonów DNA na szkiełku podstawowym. Szkiełko jest następnie montowane twarzą w twarz z drugim szkiełkiem wstępnie pokrytym odczynnikiem wychwytującym białka, a membrana nasączona ekstraktem komórkowym jest umieszczana między dwoma szkiełkami w celu zajścia transkrypcji i translacji. Nowo zsyntetyzowane białka ze znacznikiem his są następnie unieruchamiane na szkiełku, tworząc macierz. W publikacji w 18 z 20 powtórzeń udało się wygenerować kopię mikromacierzy białkowej. Potencjalnie proces można powtarzać tak często, jak to konieczne, o ile DNA nie zostanie uszkodzone przez DNAzy, degradację lub mechaniczne ścieranie.
Zalety
Wiele zalet technologii bezkomórkowych macierzy białkowych odnosi się do ograniczeń systemu ekspresji opartego na komórkach, stosowanego w tradycyjnych metodach produkcji mikromacierzy białkowych.
Szybko i ekonomicznie
Metoda pozwala uniknąć klonowania DNA (z wyjątkiem NAPPA) i umożliwia szybkie przekształcenie informacji genetycznej w funkcjonalne białka przy użyciu DNA PCR. Zredukowane etapy produkcji i możliwość miniaturyzacji systemu pozwalają zaoszczędzić na zużyciu odczynników i obniżyć koszty produkcji.
Poprawia dostępność białka
Wiele białek, w tym przeciwciała, jest trudnych do ekspresji w komórkach gospodarza z powodu problemów z nierozpuszczalnością, wiązaniami dwusiarczkowymi lub toksycznością dla komórek gospodarza. Bezkomórkowa macierz białkowa sprawia, że wiele takich białek jest dostępnych do stosowania w mikromacierzach białkowych.
Umożliwia długoterminowe przechowywanie
W przeciwieństwie do DNA, które jest wysoce stabilną cząsteczką, białka stanowią heterogeniczną klasę cząsteczek o różnej stabilności i właściwościach fizykochemicznych. Utrzymanie fałdowania i funkcji białek w stanie unieruchomionym przez długie okresy przechowywania jest dużym wyzwaniem dla mikromacierzy białkowych. Metody bezkomórkowe dają możliwość szybkiego uzyskania mikromacierzy białkowych na żądanie, eliminując tym samym wszelkie problemy związane z długotrwałym przechowywaniem.
Elastyczny
Metoda jest podatna na szereg różnych matryc: produkty PCR, plazmidy i mRNA. Podczas syntezy można włączyć dodatkowe składniki, aby dostosować środowisko do fałdowania białka, tworzenia wiązań dwusiarczkowych, modyfikacji lub aktywności białka.
Ograniczenie
- Modyfikacja potranslacyjna białek w białkach generowanych przez bezkomórkową syntezę białek jest nadal ograniczona w porównaniu z tradycyjnymi metodami i może nie być tak istotna biologicznie.
Aplikacje
Interakcje białek: badanie interakcji białko-białko i interakcji białek z innymi cząsteczkami, takimi jak metabolity , lipidy , DNA i małe cząsteczki; test hamowania enzymów: do wysokowydajnych badań przesiewowych kandydatów na leki i do odkrywania nowych enzymów do zastosowania w biotechnologii ; skrining specyficzności przeciwciał.