Bezkomórkowa synteza białek

Bezkomórkowa synteza białek , znana również jako synteza białek in vitro lub CFPS , to produkcja białek przy użyciu maszynerii biologicznej w systemie bezkomórkowym , to znaczy bez użycia żywych komórek . Środowisko in vitro nie jest ograniczone przez ścianę komórkową ani warunki homeostazy niezbędne do utrzymania żywotności komórek. W ten sposób CFPS umożliwia bezpośredni dostęp i kontrolę środowiska translacji , co jest korzystne dla wielu zastosowań, w tym kotranslacyjnej solubilizacji białek błonowych, optymalizacji produkcji białek, włączania aminokwasów nienaturalnych, znakowania selektywnego i specyficznego dla miejsca. Ze względu na otwarty charakter systemu, można badać różne warunki ekspresji, takie jak pH, potencjały redoks , temperatury i białka opiekuńcze . Ponieważ nie ma potrzeby utrzymywania żywotności komórek, mogą być wytwarzane toksyczne białka.

Wstęp

Typowe składniki reakcji bezkomórkowej obejmują ekstrakt komórkowy, źródło energii, zapas aminokwasów , kofaktorów, takich jak magnez , oraz DNA z pożądanymi genami . Ekstrakt komórkowy uzyskuje się przez lizę komórki będącej przedmiotem zainteresowania i odwirowanie ścian komórkowych, genomu DNA i innych zanieczyszczeń. Pozostałości to niezbędna maszyneria komórkowa, w tym rybosomy , syntetazy aminoacylo-tRNA , czynniki inicjacji i wydłużania translacji , nukleazy itp.

W CFPS można stosować dwa rodzaje DNA: plazmidy i liniowe matryce ekspresyjne (LET). Plazmidy są okrągłe i powstają tylko wewnątrz komórek. LET można uzyskać znacznie skuteczniej za pomocą reakcji PCR , która replikuje DNA znacznie szybciej niż hodowanie komórek w inkubatorze . Podczas gdy LET są łatwiejsze i szybsze do wykonania, wydajność plazmidów jest zwykle znacznie wyższa w CFPS. Z tego powodu wiele dzisiejszych badań koncentruje się na optymalizacji wydajności CFPS LET, aby zbliżyć się do wydajności CFPS z plazmidami.

Źródło energii jest ważną częścią reakcji bezkomórkowej. Zwykle do ekstraktu do reakcji dodaje się oddzielną mieszaninę zawierającą potrzebne źródło energii wraz z zapasem aminokwasów. Typowymi źródłami są pirogronian fosfoenolu , fosforan acetylu i fosforan kreatyny .

Zalety i zastosowania

CFPS ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjną syntezą białek in vivo . Przede wszystkim reakcja bezkomórkowa, w tym przygotowanie ekstraktu, trwa zwykle 1–2 dni, podczas gdy ekspresja białka in vivo może zająć 1–2 tygodnie.

CFPS jest otwartą reakcją. Brak ściany komórkowej umożliwia bezpośrednią manipulację środowiskiem chemicznym. Próbki są łatwo pobierane, stężenia optymalizowane, a reakcja może być monitorowana. W przeciwieństwie do tego, po wprowadzeniu DNA do żywych komórek, reakcja jest niedostępna, dopóki nie zostanie zakończona i komórki nie zostaną poddane lizie.

Kolejną zaletą CFPS jest brak troski o toksyczność. Niektóre pożądane białka i białka znakowane są toksyczne dla komórek podczas syntezy. Ponieważ nie stosuje się żywych komórek, toksyczność produktu białkowego nie stanowi istotnego problemu.

Te zalety umożliwiają wiele zastosowań. Głównym zastosowaniem CFPS jest włączanie nienaturalnych aminokwasów do struktur białkowych (patrz rozszerzony kod genetyczny ). Otwartość reakcji jest idealna do wstawiania zmodyfikowanych tRNA i nienaturalnych aminokwasów wymaganych do takiej reakcji.

Biologia syntetyczna ma wiele innych zastosowań i jest świetlaną przyszłością w takich dziedzinach, jak ewolucja białek , nanomaszyny , obwody kwasu nukleinowego i synteza cząsteczek wirusopodobnych do szczepionek i terapii lekowej .

Ograniczenia

Jednym z wyzwań związanych z CFPS jest degradacja DNA przez endogenne nukleazy w ekstrakcie komórkowym. Jest to szczególnie problematyczne w przypadku LET. Komórki mają endonukleazy , które atakują losowe miejsca nici DNA; jednak znacznie bardziej powszechne są egzonukleazy , które atakują DNA od końców. Ponieważ plazmidy są okrągłe i nie mają końca, do którego mogą przyłączać się egzonukleazy, te ostatnie nie mają na nie wpływu. LET są jednak podatne na oba. Ze względu na podatność LET wiele dzisiejszych badań koncentruje się na optymalizacji wydajności CFPS LET, aby zbliżyć się do wydajności CFPS przy użyciu plazmidów.

Jednym z przykładów tej ulepszonej ochrony za pomocą plazmidów jest zastosowanie białka gam bakteriofaga lambda . Gam jest inhibitorem RecBCD , egzonukleazy występującej w Escherichia coli ( E. coli ). Przy zastosowaniu gam wydajność CFPS z LET była znacznie zwiększona i była porównywalna z wydajnością CFPS z plazmidami. Można również wytwarzać ekstrakty PURE, eliminując obawy związane z egzonukleazami. Ekstrakty te są drogie w produkcji i obecnie nie stanowią ekonomicznego rozwiązania problemu degradacji egzogennego DNA.

Rodzaje systemów bezkomórkowych

Powszechnie używane obecnie ekstrakty komórkowe są wytwarzane z E. coli (ECE), retikulocytów króliczych (RRL), kiełków pszenicy (WGE), komórek owadzich (ICE) i drożdży Kluyveromyces (system D2P). Wszystkie te ekstrakty są dostępne w handlu.

ECE jest najpopularniejszym lizatem z kilku powodów. Jest to najtańszy ekstrakt i najmniej czasochłonny w tworzeniu. Również duże ilości E. coli można łatwo hodować, a następnie łatwo poddać lizie za pomocą homogenizatora lub sonikatora . ECE zapewnia również najwyższą wydajność białka. Jednak wysoka wydajność produkcji może ograniczyć złożoność syntetyzowanego białka, szczególnie w przypadku modyfikacji potranslacyjnych . Pod tym względem systemy eukariotyczne o niższej wydajności mogą być korzystne, pod warunkiem, że w ekstraktach zachowane zostaną układy enzymów modyfikujących.

Każdy system eukariotyczny ma swoje zalety i wady. Na przykład ekstrakt WGE daje najwyższą wydajność spośród trzech ekstraktów eukariotycznych; jednak nie jest tak skuteczny w przypadku niektórych modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja . Przy wyborze ekstraktu należy wziąć pod uwagę rodzaj modyfikacji potranslacyjnej, pożądane wydajności oraz koszt.

Historia

Bezkomórkowa synteza białek jest stosowana od ponad 60 lat, a pierwsze wyjaśnienie kodonu zostało przeprowadzone przez Marshalla Nirenberga i Heinricha J. Matthaei w 1961 roku w National Institutes of Health. Użyli systemu bezkomórkowego do translacji sekwencji poliuracylowego RNA ( lub UUUUU… w kategoriach biochemicznych ) i odkryli, że polipeptyd , który zsyntetyzowali, składał się tylko z aminokwasu fenyloalaniny . W ten sposób wywnioskowali z tej polifenyloalaniny, że kodon UUU określa aminokwas fenyloalaninę. Rozszerzając tę pracę, Nirenberg i jego współpracownicy byli w stanie określić skład nukleotydowy każdego kodonu.

Zobacz też

Spirin, A.; Baranow, W.; Ryabova, L.; Owodow S.; Ałachow, Y. (1988). „Ciągły bezkomórkowy system translacji zdolny do wytwarzania polipeptydów z wysoką wydajnością”. nauka . 242 (4882): 1162–4. Bibcode : 1988Sci...242.1162S . doi : 10.1126/science.3055301 . PMID 3055301 .

Dalsza lektura

Hartsough EM, Shah P, Larsen AC, Chaput JC (wrzesień 2015). „Analiza porównawcza systemów ekspresyjnych bez komórek eukariotycznych” . BioTechniki . 59 (3): 149–51. doi : 10.2144/000114327 . PMID 26345507 .