Rozszerzony kod genetyczny

Nie może być przesłuchu między nową parą tRNA/syntaza a istniejącymi cząsteczkami tRNA/syntaza, tylko z rybosomami

Rozszerzony kod genetyczny to sztucznie zmodyfikowany kod genetyczny , w którym jeden lub więcej specyficznych kodonów zostało ponownie przydzielonych w celu zakodowania aminokwasu , który nie należy do 22 powszechnych naturalnie kodowanych aminokwasów proteogennych .

Kluczowymi warunkami wstępnymi rozszerzenia kodu genetycznego są:

  • niestandardowy aminokwas do zakodowania,
  • niewykorzystany kodon do adopcji,
  • tRNA , który rozpoznaje ten kodon, i
  • syntetaza tRNA , która rozpoznaje tylko to tRNA i tylko niestandardowy aminokwas.

Rozszerzanie kodu genetycznego jest obszarem badań biologii syntetycznej , stosowanej dyscypliny biologicznej, której celem jest inżynieria żywych systemów do użytecznych celów. Ekspansja kodu genetycznego wzbogaca repertuar użytecznych narzędzi dostępnych nauce.

W maju 2019 roku naukowcy w ramach przełomowego wysiłku poinformowali o stworzeniu nowej syntetycznej (prawdopodobnie sztucznej ) formy zdolnego do życia życia , wariantu bakterii Escherichia coli , poprzez zmniejszenie naturalnej liczby 64 kodonów w genomie bakteryjnym do 61 kodonów (eliminując dwa z sześciu kodonów kodujących serynę i jeden z trzech kodonów stop ) - z czego 59 kodowało 20 aminokwasów .

Wstęp

Aby zapoznać się ze słownictwem, zobacz Glosariusz terminów dotyczących ekspresji genów . Aby zapoznać się z nietechnicznym wprowadzeniem do tematu, zobacz Wprowadzenie do genetyki .

Warto zauważyć, że kod genetyczny wszystkich organizmów jest zasadniczo taki sam, tak więc wszystkie żywe istoty używają tego samego „języka genetycznego”. Ogólnie rzecz biorąc, wprowadzenie nowych funkcjonalnych, nienaturalnych aminokwasów do białek żywych komórek przełamuje uniwersalność języka genetycznego, który w idealnym przypadku prowadzi do alternatywnych form życia. Białka są produkowane dzięki cząsteczkom systemu translacyjnego, które dekodują wiadomości RNA na ciąg aminokwasów. Translacja informacji genetycznej zawartej w informacyjnym RNA (mRNA) na białko jest katalizowana przez rybosomy . Transferowe RNA (tRNA) są używane jako klucze do dekodowania mRNA do zakodowanego polipeptydu . tRNA rozpoznaje specyficzny trzynukleotydowy kodon w mRNA z komplementarną sekwencją zwaną antykodonem na jednej z jego pętli. Każdy trzynukleotydowy kodon jest tłumaczony na jeden z dwudziestu naturalnie występujących aminokwasów. Istnieje co najmniej jeden kodon tRNA dla każdego kodonu, a czasami wiele kodonów koduje ten sam aminokwas. Wiele tRNA jest zgodnych z kilkoma kodonami. Enzym zwany syntetazą aminoacylo-tRNA kowalencyjnie przyłącza aminokwas do odpowiedniego tRNA. Większość komórek ma inną syntetazę dla każdego aminokwasu (20 lub więcej syntetaz). Z drugiej strony, niektóre bakterie mają mniej niż 20 syntetaz aminoacylo-tRNA i wprowadzają „brakujące” aminokwasy poprzez modyfikację strukturalnie pokrewnego aminokwasu przez enzym aminotransferazę . Cechą wykorzystywaną przy rozszerzaniu kodu genetycznego jest fakt, że syntetaza aminoacylo-tRNA często nie rozpoznaje antykodonu, ale inną część tRNA, co oznacza, że ​​gdyby antykodon uległ mutacji, kodowanie tego aminokwasu zmieniłoby się na nowy kodon. W rybosomie informacja zawarta w mRNA jest tłumaczona na określony aminokwas, gdy kodon mRNA pasuje do komplementarnego antykodonu tRNA, a przyłączony aminokwas jest dodawany do rosnącego łańcucha polipeptydowego. Po uwolnieniu z rybosomu łańcuch polipeptydowy składa się w funkcjonujące białko.

Włączenie nowego aminokwasu do kodu genetycznego wymaga kilku zmian. Po pierwsze, aby translacja nowego aminokwasu przebiegła pomyślnie, kodon, do którego nowy aminokwas jest przypisany, nie może już kodować jednego z 20 naturalnych aminokwasów. Zwykle stosuje się kodon nonsensowny ( kodon stop ) lub kodon czterozasadowy. Po drugie, wymagana jest nowa para syntetazy tRNA i aminoacylo-tRNA, nazywane są one zestawem ortogonalnym. Zestaw ortogonalny nie może przesłuchować się z zestawami endogennego tRNA i syntetazy, będąc jednocześnie funkcjonalnie kompatybilnym z rybosomem i innymi składnikami aparatu translacyjnego. Miejsce aktywne syntetazy jest modyfikowane tak, aby przyjmowało tylko nowy aminokwas. Najczęściej biblioteka zmutowanych syntetaz jest przeszukiwana pod kątem takiej, która ładuje tRNA pożądanym aminokwasem. Syntetaza jest również zmodyfikowana tak, aby rozpoznawała tylko ortogonalne tRNA. Para syntetazy tRNA jest często modyfikowana w innych bakteriach lub komórkach eukariotycznych.

W tej dziedzinie badań 20 kodowanych aminokwasów proteogennych określa się jako aminokwasy standardowe lub alternatywnie jako aminokwasy naturalne lub kanoniczne, podczas gdy dodane aminokwasy nazywane są aminokwasami niestandardowymi (NSAA) lub aminokwasami nienaturalnymi ( uAAs; termin nieużywany w artykułach dotyczących naturalnych aminokwasów niebiałkowych, takich jak fosfoseryna ) lub aminokwasów niekanonicznych.

Niestandardowe aminokwasy

Tyrozyna i niektóre syntetyczne warianty tyrozyny stosowane do znakowania białek. Zsyntetyzowano różne warianty tyrozyny, które można włączyć do białek przy użyciu rozszerzonego kodu genetycznego. Wszystkie przedstawione tutaj warianty są używane do wiązania chemicznego lub fotochemicznego. Oznacza to, że wprowadzony AA specyficznie reaguje z określoną grupą chemiczną (taką jak hydrazydy, aminy, azydki lub tiole) lub może być aktywowany promieniowaniem UV w celu usieciowania z innymi AA.

Pierwszym elementem systemu jest aminokwas, który jest dodawany do kodu genetycznego określonego szczepu organizmu.

E. coli , drożdży lub komórek ssaków dodano ponad 71 różnych NSAA . Ze względu na szczegóły techniczne (łatwiejsza synteza chemiczna NSAA, mniej przesłuchów i łatwiejsza ewolucja syntazy aminoacylo-tRNA), NSAA są na ogół większe niż standardowe aminokwasy i najczęściej mają rdzeń fenyloalaninowy, ale z dużą różnorodnością różnych podstawników. Umożliwiają one szeroki wachlarz nowych funkcji, takich jak znakowanie (patrz rysunek), jako reporter fluorescencyjny ( np. dansyloalanina) lub wytwarzanie białek translacyjnych w E. coli z eukariotycznymi modyfikacjami posttranslacyjnymi ( np. fosfoseryna, fosfotreonina i fosfotyrozyna).

Praca założycielska została opisana przez Rolfa Furtera, który samodzielnie wykorzystał parę drożdży tRNA Phe / PheRS do włączenia p-jodofenyloalaniny do E.coli .

Aminokwasy nienaturalne włączone do białek obejmują aminokwasy zawierające ciężkie atomy w celu ułatwienia niektórych rentgenowskich badań krystalograficznych; aminokwasy o nowych właściwościach sterycznych/pakujących i elektronicznych; fotosieciujące aminokwasy, które można wykorzystać do badania interakcji białko-białko in vitro lub in vivo; aminokwasy zawierające keto, acetylen, azydek i boronian, które można stosować do selektywnego wprowadzania dużej liczby biofizycznych sond, znaczników i nowych chemicznych grup funkcyjnych do białek in vitro lub in vivo ; aminokwasy aktywne redoks do sondowania i modulowania transferu elektronów; fotoklatkowe i fotoizomeryzowalne aminokwasy do fotoregulacji procesów biologicznych; aminokwasy wiążące metale do katalizy i wykrywania jonów metali; aminokwasy, które zawierają fluorescencyjne lub aktywne w podczerwieni łańcuchy boczne do badania struktury i dynamiki białek; α-hydroksykwasy i D -aminokwasy jako sondy konformacji szkieletu i oddziaływań wiązań wodorowych; oraz siarczanowane aminokwasy i mimetyki aminokwasów fosforylowanych jako sondy modyfikacji potranslacyjnych.

Dostępność niestandardowego aminokwasu wymaga, aby organizm albo zaimportował go z pożywki, albo dokonał biosyntezy. W pierwszym przypadku nienaturalny aminokwas jest najpierw syntetyzowany chemicznie w swojej optycznie czystej postaci L. Następnie dodaje się go do pożywki wzrostowej komórki. Biblioteka związków jest zwykle testowana pod kątem zastosowania do włączenia nowego aminokwasu, ale nie zawsze jest to konieczne, na przykład różne systemy transportowe mogą obsługiwać nienaturalne aminokwasy z niepolarnymi łańcuchami bocznymi. W drugim przypadku należy zaprojektować szlak biosyntezy, na przykład E. coli , który biosyntetyzuje nowy aminokwas (p-aminofenyloalaninę) z podstawowych źródeł węgla i włącza go do swojego kodu genetycznego. Inny przykład: produkcja fosfoseryny, naturalnego metabolitu, a co za tym idzie, wymagała zmiany strumienia jej szlaku w celu zwiększenia jej produkcji.

Przypisanie kodonów

Kolejnym elementem systemu jest kodon, który należy przypisać nowemu aminokwasowi.

Głównym problemem związanym z ekspansją kodu genetycznego jest brak wolnych kodonów. Kod genetyczny ma nielosowy układ, który wykazuje charakterystyczne oznaki różnych faz pierwotnej ewolucji, jednak od tego czasu zamroził się i jest prawie powszechnie konserwowany. Niemniej jednak niektóre kodony są rzadsze niż inne. W rzeczywistości u E. coli (i wszystkich organizmów) użycie kodonów nie jest równe, ale występuje kilka rzadkich kodonów (patrz tabela), z których najrzadszym jest bursztynowy kodon stop (UAG).

Supresja kodonów bursztynu

Możliwość ponownego przypisania kodonów została zrealizowana przez Normanly i in. w 1990 r., kiedy zdolny do życia zmutowany szczep E. coli odczytał kodon stop UAG („bursztynowy”) . Było to możliwe dzięki rzadkości występowania tego kodonu oraz faktowi, że sam czynnik uwalniania 1 powoduje, że kodon bursztynowy kończy translację. Później, w Schultza , syntetaza tRNATyr/tyrozylo-tRNA (TyrRS) z Methanococcus jannaschii , archebakterii, została użyta do wprowadzenia tyrozyny zamiast STOP, domyślnej wartości bursztynowego kodonu. Było to możliwe dzięki różnicom między endogennymi syntazami bakteryjnymi a ortologiczną syntazą archeologiczną, które się nie rozpoznają. Następnie grupa wyewoluowała parę ortogonalnych tRNA/syntaza, aby wykorzystać niestandardowy aminokwas O -metylotyrozynę. Po nim nastąpiła większa naftyloalanina i fotosieciująca benzoilofenyloalanina, co dowiodło potencjalnej użyteczności systemu.

Kodon bursztynowy jest najmniej używanym kodonem w Escherichia coli , ale przejęcie go powoduje znaczną utratę sprawności. W rzeczywistości jedno badanie wykazało, że odczytanie miało duży wpływ na co najmniej 83 peptydy. Ponadto oznakowanie było niekompletne. W rezultacie wykonano kilka szczepów w celu zmniejszenia kosztów sprawności, w tym usunięcia wszystkich bursztynowych kodonów z genomu. W większości E. coli K-12 (tj. Escherichia coli (biologia molekularna) dla rodowodów szczepów) występuje 314 kodonów stop UAG. W związku z tym ich zastąpienie wymagało ogromnej pracy. Jedno podejście, zapoczątkowane przez grupę prof. George'a Churcha z Harvardu, zostało nazwane MAGE in CAGE: polegało ono na transformacji multipleksowej i późniejszej rekombinacji szczepów w celu usunięcia wszystkich kodonów UAG - ta ostatnia część stanowiła punkt zatrzymania w pierwszym artykule, ale została pokonać. Doprowadziło to do E. coli C321.ΔA, któremu brakuje wszystkich kodonów UAG i RF1. Pozwoliło to na przeprowadzenie eksperymentu z tym szczepem, aby „uzależnić” go od aminokwasu bifenyloalaniny poprzez ewolucję kilku kluczowych enzymów, aby wymagały go strukturalnie, a tym samym poddanie jego rozszerzonego kodu genetycznego selekcji pozytywnej.

Rzadkie zmiany sensownych kodonów

Oprócz kodonu bursztynowego rozważano również użycie rzadkich kodonów sensownych. Kodon AGG koduje argininę, ale szczep został z powodzeniem zmodyfikowany tak, aby kodował 6- N -alliloksykarbonylo-lizynę. Innym kandydatem jest kodon AUA, który jest niezwykły, ponieważ jego odpowiedni tRNA musi różnicować się z AUG, który koduje metioninę (głównie izoleucynę, stąd jej lokalizacja). Aby to zrobić, AUA tRNA ma specjalną zasadę, lizydynę. Delecja syntazy ( tilS ) była możliwa dzięki zastąpieniu natywnego tRNA tRNA z Mycoplasma mobile (bez lizydyny). Zmniejszona sprawność jest pierwszym krokiem w kierunku wywarcia presji na szczep, aby utracił wszystkie instancje AUA, umożliwiając wykorzystanie go do rozszerzenia kodu genetycznego.

Cztery podstawowe (kwadrupletowe) kodony

Podczas gdy kodony trypletowe są w naturze podstawą kodu genetycznego, zaprogramowane przesunięcie ramki o +1 jest naturalnym procesem, który pozwala na użycie sekwencji czterech nukleotydów (kodon kwadrupletowy) do zakodowania aminokwasu. Niedawne postępy w inżynierii kodu genetycznego wykazały również, że kodon kwadrupletowy można wykorzystać do kodowania niestandardowych aminokwasów w warunkach eksperymentalnych. Pozwoliło to na jednoczesne zastosowanie dwóch nienaturalnych aminokwasów, p -azydofenyloalaniny (pAzF) i N6-[(2-propynyloksy)karbonylo]lizyny (CAK), które sieciują się wzajemnie poprzez cykloaddycję Huisgena . Czterokrotne dekodowanie w nierekodowanych szczepach typu dzikiego jest bardzo nieefektywne. Wynika to z faktu, że interakcja między zmodyfikowanymi tRNA z trójskładnikowymi kompleksami lub innymi komponentami translacyjnymi nie jest tak korzystna i silna jak z endogennymi elementami translacyjnymi komórki. Problem ten można przezwyciężyć poprzez specyficzną inżynierię i ewolucję tRNA, które może dekodować kodony kwadrupletów w nierekodowanych szczepach. W ten sposób można wygenerować do 4 różnych ortogonalnych par syntetazy tRNA/tRNA kwadrupletów. Podejście do dekodowania kodonów kwadrupletowych zastosowano również do konstrukcji szczepionki przeciwko HIV-1.

para tRNA/syntetaza

Kolejnym kluczowym elementem jest para tRNA/syntetaza.

Ortologiczny zestaw syntetazy i tRNA można zmutować i przeszukać poprzez ukierunkowaną ewolucję, aby naładować tRNA innym, nawet nowym aminokwasem. Mutacje do plazmidu zawierającego parę można wprowadzić za pomocą podatnego na błędy PCR lub zdegenerowanych starterów dla miejsca aktywnego syntetazy. Selekcja obejmuje wiele rund dwuetapowego procesu, w którym plazmid jest przenoszony do komórek wyrażających acetylotransferazę chloramfenikolu z przedwczesnym bursztynowym kodonem. W obecności toksycznego chloramfenikolu i nienaturalnego aminokwasu komórki, które przeżyły, zastąpią bursztynowy kodon przy użyciu ortogonalnego tRNA aminoacylowanego albo standardowymi aminokwasami, albo nienaturalnymi. Aby usunąć ten pierwszy, plazmid wprowadza się do komórek z genem barnazy (toksycznym) z przedwczesnym kodonem bursztynowym, ale bez nienaturalnego aminokwasu, usuwając wszystkie ortogonalne syntazy, które nie rozpoznają specyficznie nienaturalnego aminokwasu. Oprócz przekodowania tRNA do innego kodonu, można je zmutować, aby rozpoznać czterozasadowy kodon, umożliwiając dodatkowe wolne opcje kodowania. W rezultacie ten nienaturalny aminokwas wprowadza różnorodne właściwości fizykochemiczne i biologiczne, aby można go było wykorzystać jako narzędzie do badania struktury i funkcji białek lub do tworzenia nowych lub ulepszonych białek do celów praktycznych.

Opracowano kilka metod selekcji syntetazy, która akceptuje tylko nienaturalny aminokwas. Jednym z nich jest użycie kombinacji selekcji pozytywnej i negatywnej

Zbiory ortogonalne w organizmach modelowych

Ortogonalne pary syntetazy i tRNA, które działają dla jednego organizmu, mogą nie działać dla innego, ponieważ syntetaza może błędnie aminoacylować endogenne tRNA lub sam tRNA być błędnie aminoacylowany przez endogenną syntetazę. W rezultacie tworzone do tej pory zestawy różnią się między organizmami.

Para Źródło E coli Drożdże Ssaki Uwagi i odniesienia
tRNA Tyr -TyrRS Methanococcus jannaschii Tak NIE NIE
tRNA Lys -LysRS Pyrococcus horikoshii Tak NIE NIE
tRNA Glu -GluRS Pyrococcus horikoshii Tak NIE NIE
tRNA Leu – LeuRS
tRNA: mutant Halobacterium sp. RS: Methanobacterium thermoautotrophicum 		Tak NIE NIE
tRNA Amber -PylRS Methanosarcina barkeri i Methanosarcina mazei Tak Tak Tak
tRNA Bursztyn - 3-jodotyrozylo -RS RS: odmiana Methanocaldococcus jannaschii aaRS Tak NIE NIE
tRNA Tyr/Amber -TyrRS Escherichia coli NIE Tak NIE Zgłoszony w 2003 r., wymieniony w 2014 r. LeuRS
tRNA i Met -GlnRS
tRNA: ludzki RS: Escherichia coli 		NIE Tak NIE Przełączony na kodon Amber.
tRNA i fMet -TyrRS
tRNA: Escherichia coli RS: S. cerevisiae 		Tak Tak NIE Przełączony na kodon Amber.
tRNA Leu/Bursztyn -LeuRS Escherichia coli NIE Tak Tak Zgłoszony w 2004 roku i zmutowany dla kwasu 2-aminooktanowego, o -metylotyrozyny i o- nitrobenzylocysteiny. Ewoluował w drożdżach dla 4,5-dimetoksy-2-nitrobenzyloseryny, testowany na myszach i komórkach ssaków z światłoczułą 4,5-dimetoksy-2-nitrobenzylo-cysteiną.
tRNA Tyr -TyrRS Bacillus stearothermophilus NIE NIE Tak
tRNA Trp -TrpRS Bacillus subtilis , zmodyfikowany RS NIE NIE Tak Nowy AA to 5-OH Trp.

W 2017 roku zgłoszono mysz zmodyfikowaną z rozszerzonym kodem genetycznym, która może wytwarzać białka z nienaturalnymi aminokwasami.

Rybosomy ortogonalne

Podobnie jak ortogonalne tRNA i syntetazy aminoacylo-tRNA (aaRS), ortogonalne rybosomy zostały zaprojektowane tak, aby działały równolegle do naturalnych rybosomów. Ortogonalne rybosomy idealnie wykorzystują inne transkrypty mRNA niż ich naturalne odpowiedniki i ostatecznie powinny również korzystać z oddzielnej puli tRNA. Powinno to złagodzić część utraty sprawności, która obecnie nadal wynika z technik, takich jak supresja kodonów Amber. Ponadto ortogonalne rybosomy można mutować i optymalizować do określonych zadań, takich jak rozpoznawanie kodonów czworaczków. Taka optymalizacja nie jest możliwa lub wysoce niekorzystna dla naturalnych rybosomów.

o-rybosom

W 2005 roku opublikowano trzy zestawy rybosomów, które nie rozpoznawały naturalnego mRNA, ale zamiast tego dokonały translacji oddzielnej puli ortogonalnego mRNA (o-mRNA). Osiągnięto to poprzez zmianę rozpoznawanej sekwencji mRNA, sekwencji Shine-Dalgarno i odpowiadającej jej sekwencji rozpoznawanej w 16S rRNA rybosomów, tak zwanej sekwencji Anti-Shine-Darlgarno. W ten sposób parowanie zasad, które zwykle jest tracone w przypadku zmutowania jednej z sekwencji, pozostaje dostępne. Jednak mutacje w 16S rRNA nie były ograniczone do nukleotydów w oczywisty sposób parujących zasady klasycznej sekwencji Anti-Shine-Darlgarno.

Rybo-X

W 2007 roku grupa Jasona W. Chin przedstawiła ortogonalny rybosom, który został zoptymalizowany pod kątem supresji kodonów Amber. 16S rRNA zostało zmutowane w taki sposób, że wiązało czynnik uwalniania RF1 słabiej niż naturalny rybosom. Ten rybosom nie wyeliminował problemu obniżonej sprawności komórek spowodowanej stłumionymi kodonami stop w białkach naturalnych. Jednak dzięki ulepszonej specyficzności znacznie zwiększył wydajność prawidłowo syntetyzowanego białka docelowego (od ~20% do >60% procent dla stłumienia jednego bursztynowego kodonu i od <1% do >20% dla dwóch kodonów bursztynowych).

Rybo-Q

W 2010 roku grupa Jasona W. Chin przedstawiła dalszą zoptymalizowaną wersję ortogonalnego rybosomu. Ribo-Q to 16S rRNA zoptymalizowany do rozpoznawania tRNA, które mają poczwórne antykodony do rozpoznawania poczwórnych kodonów zamiast naturalnych kodonów trypletowych. Przy takim podejściu liczba możliwych kodonów wzrasta z 64 do 256. Nawet biorąc pod uwagę różnorodność kodonów stop, w ten sposób potencjalnie można zakodować ponad 200 różnych aminokwasów.

Zszywanie rybosomów

Opisane powyżej ortogonalne rybosomy koncentrują się na optymalizacji 16S rRNA. Jak dotąd ten zoptymalizowany rRNA 16S łączono z naturalnymi dużymi podjednostkami, tworząc ortogonalne rybosomy. Jeśli rRNA 23S, główny składnik RNA dużej podjednostki rybosomu, również ma być zoptymalizowany, należy upewnić się, że nie było przesłuchu w zespole ortogonalnych i naturalnych rybosomów (patrz rysunek X B). Aby zapewnić, że zoptymalizowany 23S rRNA utworzy rybosomy tylko ze zoptymalizowanym 16S rRNA, dwa rRNA połączono w jeden transkrypt. Wstawiając sekwencję 23S rRNA do regionu pętli sekwencji 16S rRNA, obie podjednostki nadal przyjmują funkcjonujące fałdy. Ponieważ dwa rRNA są połączone, a zatem w stałej bliskości, korzystnie wiążą się ze sobą, a nie z innymi swobodnie pływającymi podjednostkami rybosomu.

Zaprojektowane centrum transferazy peptydylowej


W 2014 roku wykazano, że zmieniając centrum transferazy peptydylowej 23S rRNA, można stworzyć rybosomy, które czerpią z ortogonalnych pul tRNA. Koniec 3' tRNA jest powszechnie konserwowany jako CCA. Dwie pary zasad cytydyny z dwiema guaninami 23S rRNA wiążą tRNA z rybosomem. Ta interakcja jest wymagana dla wierności translacji. Jednak poprzez komutację nukleotydów wiążących w taki sposób, że nadal mogą tworzyć pary zasad, można zachować wierność translacji. Koniec 3' tRNA jest zmutowany z CCA do CGA, podczas gdy dwa nukleotydy cytydyny w miejscach A i P rybosomów są zmutowane do guanidyny. Prowadzi to do rybosomów, które nie akceptują naturalnie występujących tRNA jako substratów oraz do tRNA, które nie mogą być użyte jako substraty przez naturalne rybosomy. Aby skutecznie wykorzystać takie tRNA, musiałyby zostać aminoacylowane przez specyficzne, ortogonalne aaRS. Większość naturalnie występujących aaRS rozpoznaje koniec 3' odpowiadającego im tRNA. aaRS dla tych 3'-zmutowanych tRNA nie są jeszcze dostępne. Jak dotąd wykazano, że ten system działa tylko w translacji in vitro , gdzie aminoacylację ortogonalnego tRNA osiągnięto za pomocą tak zwanych „flexizymów”. Flexizymy to rybozymy o aktywności aminoakrylacji tRNA.

Aplikacje

Dzięki rozszerzonemu kodowi genetycznemu nienaturalny aminokwas może być genetycznie skierowany do dowolnego wybranego miejsca w białku będącym przedmiotem zainteresowania. Wysoka wydajność i wierność tego procesu pozwala na lepszą kontrolę umiejscowienia modyfikacji w porównaniu z posttranslacyjną modyfikacją białka, która na ogół będzie ukierunkowana na wszystkie aminokwasy tego samego typu, takie jak grupa tiolowa cysteiny i grupa aminowa lizyny. Ponadto rozszerzony kod genetyczny umożliwia przeprowadzanie modyfikacji in vivo . Zdolność do specyficznego dla miejsca kierowania zsyntetyzowanych w laboratorium ugrupowań chemicznych do białek pozwala na wiele rodzajów badań, które w przeciwnym razie byłyby niezwykle trudne, takich jak:

  • Sondowanie struktury i funkcji białek: Dzięki zastosowaniu aminokwasów o nieco innej wielkości, takich jak O -metylotyrozyna lub dansyloalanina zamiast tyrozyny, oraz poprzez wstawienie genetycznie zakodowanych ugrupowań reporterowych (zmieniających kolor i/lub aktywnych wirowo) o strukturze i funkcji białka można zmierzyć.
  • Badanie roli modyfikacji potranslacyjnych w strukturze i funkcji białek: przy użyciu aminokwasów naśladujących modyfikacje potranslacyjne , takich jak fosfoseryna, można uzyskać białko aktywne biologicznie, a specyficzna dla miejsca natura włączania aminokwasów może prowadzić do informacji od tego, w jaki sposób pozycja, gęstość i rozkład fosforylacji białek wpływają na funkcję białek.
  • Identyfikacja i regulacja aktywności białek: Dzięki zastosowaniu aminokwasów umieszczonych w fotoklatkach, funkcja białek może być „włączana” lub wyłączana poprzez oświetlanie organizmu.
  • Zmiana sposobu działania białka: można zacząć od genu białka, które wiąże określoną sekwencję DNA, i poprzez wstawienie aktywnego chemicznie aminokwasu w miejsce wiązania przekształcić go w białko, które przecina DNA, a nie wiążąc to.
  • Poprawa immunogenności i przezwyciężenie samotolerancji: Zastępując strategicznie wybrane tyrozyny p -nitrofenyloalaniną, tolerowane białko własne może stać się immunogenne.
  • Selektywne niszczenie wybranych składników komórkowych: przy użyciu rozszerzonego kodu genetycznego nienaturalne, destrukcyjne cząsteczki chemiczne (czasami nazywane „głowicami chemicznymi”) można włączyć do białek, które celują w określone składniki komórkowe.
  • Wytwarzanie lepszego białka: ewolucja bakteriofagów T7 na nieewoluującym szczepie E. coli , który kodował 3-jodotyrozynę w bursztynowym kodonie, zaowocowała populacją lepiej sprawną niż typ dziki dzięki obecności jodotyrozyny w jej proteomie
  • Sondowanie lokalizacji białek i interakcji białko-białko u bakterii.

Przyszły

Ekspansja kodu genetycznego jest wciąż w powijakach. Obecna metodologia wykorzystuje w danym momencie tylko jeden niestandardowy aminokwas, podczas gdy w idealnym przypadku można by użyć wielu. W rzeczywistości grupa Jasona China niedawno pobiła rekord genetycznie zmodyfikowanego E. coli , który może jednocześnie zawierać do 4 nienaturalnych aminokwasów. Ponadto opracowano oprogramowanie, które umożliwia łączenie ortogonalnych rybosomów i nienaturalnych par tRNA/RS w celu poprawy wydajności i wierności białka.

Przekodowany syntetyczny genom

Jednym ze sposobów osiągnięcia kodowania wielu nienaturalnych aminokwasów jest synteza przepisanego genomu. W 2010 roku kosztem 40 milionów dolarów skonstruowano organizm Mycoplasma laboratorium , który był kontrolowany przez syntetyczny, ale nie przekodowany genom. Pierwszy genetycznie zrekodowany organizm powstał dzięki współpracy laboratoriów George'a Churcha i Farrena Isaacsa, kiedy E. coli MG1655 typu dzikiego została zrekodowana w taki sposób, że wszystkie 321 znanych kodonów stop (UAG) zostało zastąpionych synonimami UAA kodony i uwolnienie czynnik 1 został wyeliminowany w celu wyeliminowania interakcji z egzogennym kodonem stop i poprawy nienaturalnej syntezy białek. W 2019 roku powstała Escherichia coli Syn61, z przekodowanym genomem o wielkości 4 megabaz, składającym się tylko z 61 kodonów zamiast naturalnych 64. Oprócz wyeliminowania stosowania rzadkich kodonów, należy zwiększyć specyficzność systemu o tyle, ile tRNA rozpoznać kilka kodonów

Rozszerzony alfabet genetyczny

Główny artykuł: nienaturalna para zasad

Innym podejściem jest zwiększenie liczby zasad nukleinowych w celu zwiększenia zdolności kodowania.

Nienaturalna para zasad (UBP) to zaprojektowana podjednostka (lub nukleozasada ) DNA , która jest tworzona w laboratorium i nie występuje w naturze. Demonstracja UBP została przeprowadzona in vitro przez grupę Ichiro Hirao w instytucie RIKEN w Japonii. W 2002 roku opracowali nienaturalną parę zasad między 2-amino-8-(2-tienylo)puryną (s) a pirydyno-2-onem (y), która działa in vitro w transkrypcji i translacji w celu specyficznego dla miejsca włączenia nie -standardowe aminokwasy w białka. W 2006 roku stworzyli 7-(2-tienylo)imidazo[4,5-b]pirydynę (Ds) i pirolo-2-karbaldehyd (Pa) jako trzecią parę zasad do replikacji i transkrypcji. Następnie Ds i 4-[3-(6-aminoheksanamido)-1-propynylo]-2-nitropirol (Px) odkryto jako parę o wysokiej wierności w amplifikacji PCR. W 2013 roku zastosowali parę Ds-Px do generowania aptameru DNA poprzez in vitro (SELEX) i wykazali, że ekspansja alfabetu genetycznego znacznie zwiększa powinowactwo aptameru DNA do docelowych białek.

W 2012 roku grupa amerykańskich naukowców kierowana przez Floyda Romesberga, biologa chemicznego z Scripps Research Institute w San Diego w Kalifornii, opublikowała, że ​​jego zespół zaprojektował nienaturalną parę zasad (UBP). Dwa nowe sztuczne nukleotydy lub nienaturalna para zasad (UBP) zostały nazwane „ d5SICS ” i „ dNaM ”. Mówiąc bardziej technicznie, te sztuczne nukleotydy zawierające hydrofobowe nukleozasady zawierają dwa skondensowane pierścienie aromatyczne , które tworzą kompleks (d5SICS – dNaM) lub parę zasad w DNA. W 2014 roku ten sam zespół z Instytutu Badawczego Scripps poinformował, że zsyntetyzował odcinek kolistego DNA znanego jako plazmid zawierający naturalne pary zasad TA i CG wraz z najlepiej działającym laboratorium UBP Romesberg, które zaprojektowało, i wstawił go do komórek wspólnego bakteria E. coli , która z powodzeniem replikowała nienaturalne pary zasad przez wiele pokoleń. Jest to pierwszy znany przykład żywego organizmu przekazującego rozszerzony kod genetyczny kolejnym pokoleniom. Osiągnięto to częściowo dzięki dodaniu wspomagającego genu alg, który wykazuje ekspresję trifosforanów nukleotydów , który skutecznie importuje trifosforany zarówno d5SICSTP, jak i dNaMTP do bakterii E. coli . Następnie wykorzystują je naturalne szlaki replikacji bakterii do dokładnej replikacji plazmidu zawierającego d5SICS–dNaM.

Udane włączenie trzeciej pary zasad do żywego mikroorganizmu jest znaczącym przełomem w kierunku znacznego rozszerzenia liczby aminokwasów, które mogą być kodowane przez DNA, zwiększając w ten sposób potencjał żywych organizmów do produkcji nowych białek . Sztuczne łańcuchy DNA jeszcze niczego nie kodują, ale naukowcy spekulują, że można by je zaprojektować do produkcji nowych białek, które mogłyby mieć zastosowania przemysłowe lub farmaceutyczne.

W maju 2014 r. naukowcy ogłosili, że pomyślnie wprowadzili dwa nowe sztuczne nukleotydy do bakteryjnego DNA, a poprzez włączenie pojedynczych sztucznych nukleotydów do pożywki hodowlanej byli w stanie wywołać amplifikację plazmidów zawierających sztuczne nukleotydy o współczynnik 2 x 10 7 (24 podwojenia); nie stworzyli mRNA ani białek zdolnych do wykorzystania sztucznych nukleotydów.

Powiązane metody

Metoda selektywnej inkorporacji ciśnieniowej (SPI) do produkcji alloprotein

Przeprowadzono wiele badań, w których wyprodukowano białko z niestandardowymi aminokwasami, ale nie zmieniały one kodu genetycznego. Te białka, zwane alloproteinami , są wytwarzane przez inkubację komórek z nienaturalnym aminokwasem pod nieobecność podobnego kodowanego aminokwasu, aby ten pierwszy został włączony do białka w miejsce drugiego, na przykład kwas L -2-aminoheksanowy ( Ahx) dla metioniny (Met).

Badania te opierają się na naturalnej rozwiązłej aktywności syntetazy aminoacylo-tRNA w celu dodania do docelowego tRNA nienaturalnego aminokwasu (tj. analogu) podobnego do naturalnego substratu, na przykład syntazy metionylo-tRNA mylącej izoleucynę z metioniną. Na przykład w krystalografii białek dodanie selenometioniny do pożywki hodowli szczepu auksotroficznego metioniny skutkuje białkami zawierającymi selenometioninę w przeciwieństwie do metioniny ( tj. anomalna dyspersja o wielu długościach fal z jakiegoś powodu). Innym przykładem jest to, że fotoleucyna i fotometionina są dodawane zamiast leucyny i metioniny do znakowanego krzyżowo białka. Podobnie, niektóre grzyby tolerujące tellur mogą włączać tellurocysteinę i tellurometioninę do swojego białka zamiast cysteiny i metioniny. Cel rozszerzenia kodu genetycznego jest bardziej radykalny, ponieważ nie zastępuje aminokwasu, ale dodaje jeden lub więcej do kodu. Z drugiej strony, zastąpienia całego proteomu są najskuteczniej przeprowadzane przez globalne podstawienia aminokwasów. E. coli i B. subtilis próbowano globalnych podstawień w całym proteomie naturalnych aminokwasów fluorowanymi analogami . Całkowitą tryptofanu tienopirolo-alaniną w odpowiedzi na 20899 kodonów UGG w E. coli opisali w 2015 roku Budisa i Söll . Ponadto wiele zjawisk biologicznych, takich jak fałdowanie i stabilność białek, opiera się na efektach synergistycznych w wielu pozycjach w sekwencji białka.

W tym kontekście metoda SPI generuje rekombinowane warianty białek lub alloproteiny bezpośrednio poprzez zastąpienie naturalnych aminokwasów nienaturalnymi odpowiednikami. Auksotroficzny gospodarz ekspresji aminokwasów jest uzupełniany analogiem aminokwasu podczas ekspresji białka docelowego. Takie podejście pozwala uniknąć pułapek metod opartych na tłumieniu i przewyższa je pod względem wydajności, odtwarzalności i niezwykle prostej konfiguracji eksperymentalnej. Liczne badania wykazały, w jaki sposób globalne zastąpienie aminokwasów kanonicznych różnymi analogami izosterycznymi spowodowało minimalne zaburzenia strukturalne, ale dramatyczne zmiany właściwości termodynamicznych, fałdowania, agregacji widmowej i aktywności enzymatycznej.

synteza in vitro

Główny artykuł: prezentacja mRNA

Ekspansja kodu genetycznego opisana powyżej zachodzi in vivo . Alternatywą jest zmiana kodowania in vitro . Wymaga to wyczerpania wszystkich tRNA i selektywnego ponownego wprowadzenia niektórych aminoacylowanych tRNA, niektórych aminoacylowanych chemicznie.

Synteza chemiczna

Główny artykuł: Synteza peptydów

Istnieje kilka technik chemicznego wytwarzania peptydów , na ogół jest to chemia ochrony w fazie stałej. Oznacza to, że każdy (zabezpieczony) aminokwas może zostać dodany do powstającej sekwencji.

W listopadzie 2017 roku zespół z Scripps Research Institute poinformował, że skonstruował półsyntetyczny genom bakterii E. coli przy użyciu sześciu różnych nukleotydów (w porównaniu z czterema występującymi w naturze). Dwie dodatkowe „litery” tworzą trzecią, nienaturalną parę zasad. Powstałe organizmy były w stanie rozwijać się i syntetyzować białka przy użyciu „nienaturalnych aminokwasów”. Zastosowana nienaturalna para zasad to dNaM – dTPT3. Ta nienaturalna para zasad została zademonstrowana wcześniej, ale jest to pierwsze doniesienie o transkrypcji i translacji białek przy użyciu nienaturalnej pary zasad.

Zobacz też

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Expanded_genetic_code&oldid=1140783867 ”