Biblioteka (biologia)

Mutageneza nasycenia miejsca jest rodzajem mutagenezy ukierunkowanej . Ten obraz przedstawia mutagenezę wysycenia pojedynczej pozycji w teoretycznym białku o 10 resztach. Wersja białka typu dzikiego jest pokazana na górze, gdzie M oznacza metioninę pierwszego aminokwasu, a * oznacza zakończenie translacji. Wszystkie 19 mutantów izoleucyny w pozycji 5 pokazano poniżej.

Jak biblioteki DNA generowane przez losową mutagenezę w przestrzeni sekwencji próbek. Pokazano aminokwas podstawiony w danej pozycji. Każda kropka lub zestaw połączonych kropek to jeden element biblioteki. Podatny na błędy PCR losowo mutuje niektóre reszty do innych aminokwasów. Skanowanie alaniną zastępuje każdą resztę białka alaniną, jedna po drugiej. Nasycenie miejsca zastępuje każdy z 20 możliwych aminokwasów (lub niektóre ich podzbiory) w jednej pozycji, jeden po drugim.

W biologii molekularnej biblioteka to zbiór fragmentów DNA przechowywanych i rozmnażanych w populacji mikroorganizmów w procesie klonowania molekularnego . Istnieją różne rodzaje bibliotek DNA, w tym biblioteki cDNA (utworzone z RNA poddanego odwrotnej transkrypcji ), biblioteki genomowe (utworzone z genomowego DNA) i biblioteki randomizowanych mutantów (utworzone przez syntezę genów de novo, w której włączone są alternatywne nukleotydy lub kodony). Technologia bibliotek DNA jest podstawą współczesnej biologii molekularnej , inżynieria genetyczna i inżynieria białek , a zastosowania tych bibliotek zależą od źródła pochodzenia oryginalnych fragmentów DNA. Istnieją różnice w wektorach do klonowania i technikach stosowanych w przygotowaniu bibliotek, ale generalnie każdy fragment DNA jest w unikalny sposób wstawiany do wektora do klonowania, a pula rekombinowanych cząsteczek DNA jest następnie przenoszona do populacji bakterii ( sztuczny chromosom bakteryjny lub biblioteka BAC) lub drożdży tak, że każdy organizm zawiera średnio jeden konstrukt (wektor + wstawka). Gdy populacja organizmów rośnie w kulturze, cząsteczki DNA w nich zawarte są kopiowane i rozmnażane (a więc „klonowane”).

Terminologia

Termin „biblioteka” może odnosić się do populacji organizmów, z których każdy zawiera cząsteczkę DNA wprowadzoną do wektora do klonowania lub alternatywnie do zbioru wszystkich sklonowanych cząsteczek wektorów.

Biblioteki cDNA

Biblioteka cDNA reprezentuje próbkę mRNA oczyszczonego z określonego źródła (ze zbioru komórek, określonej tkanki lub całego organizmu), która została przekształcona z powrotem w matrycę DNA przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy . Reprezentuje zatem geny, które były aktywnie transkrybowane w tym konkretnym źródle w warunkach fizjologicznych, rozwojowych lub środowiskowych, które istniały, gdy mRNA był oczyszczany. Biblioteki cDNA można generować przy użyciu technik promujących klony „pełnej długości” lub w warunkach generujących krótsze fragmenty wykorzystywane do identyfikacji „ wyrażone znaczniki sekwencji „.

Biblioteki cDNA są przydatne w genetyce odwrotnej, ale reprezentują tylko bardzo małą (mniej niż 1%) część całego genomu danego organizmu.

Zastosowania bibliotek cDNA obejmują:

Odkrycie nowych genów
Klonowanie cząsteczek cDNA pełnej długości do badań funkcji genów in vitro
Badanie repertuaru mRNA ulegających ekspresji w różnych komórkach lub tkankach
Badanie alternatywnego splicingu w różnych komórkach lub tkankach

Biblioteki genomowe

Biblioteka genomowa to zestaw klonów, które razem reprezentują cały genom danego organizmu. Liczba klonów, które tworzą bibliotekę genomową, zależy od (1) wielkości danego genomu i (2) wielkości wstawki tolerowanej przez konkretny wektora do klonowania . Z praktycznego punktu widzenia tkankowe źródło genomowego DNA nie ma znaczenia, ponieważ każda komórka ciała zawiera praktycznie identyczne DNA (z pewnymi wyjątkami).

Zastosowania bibliotek genomowych obejmują:

Określenie pełnej sekwencji genomu danego organizmu (patrz projekt genomu )
Służy jako źródło sekwencji genomowej do generowania zwierząt transgenicznych poprzez inżynierię genetyczną
Badanie funkcji sekwencji regulatorowych in vitro
Badanie mutacji genetycznych w tkankach nowotworowych

Biblioteki syntetycznych mutantów

Przedstawienie jednego powszechnego sposobu klonowania biblioteki ukierunkowanej mutagenezy (tj. przy użyciu zdegenerowanych oligo). Gen będący przedmiotem zainteresowania jest PCRed z oligo, które zawierają region, który jest doskonale komplementarny do matrycy (niebieski) i taki, który różni się od matrycy o jeden lub więcej nukleotydów (czerwony). Wiele takich starterów zawierających degenerację w regionie niekomplementarnym łączy się w tę samą PCR, co daje wiele różnych produktów PCR z różnymi mutacjami w tym regionie (poszczególne mutanty pokazane poniżej różnymi kolorami).

W przeciwieństwie do typów bibliotek opisanych powyżej, istnieje wiele sztucznych metod tworzenia bibliotek wariantów genów. Zmienność w całym genie można wprowadzać losowo za pomocą podatnego na błędy PCR , tasowania DNA w celu rekombinacji części podobnych genów razem lub metod opartych na transpozonach w celu wprowadzenia indeli . Alternatywnie, mutacje mogą być ukierunkowane na określone kodony podczas syntezy de novo lub mutagenezy nasycającej w celu skonstruowania jednego lub większej liczby mutantów punktowych genu w sposób kontrolowany. Powoduje to powstanie mieszaniny dwuniciowych cząsteczek DNA, które reprezentują warianty oryginalnego genu.

Ekspresjonowane białka z tych bibliotek można następnie przeszukiwać pod kątem wariantów, które wykazują korzystne właściwości (np. stabilność, powinowactwo wiązania lub aktywność enzymatyczną) . Można to powtarzać w cyklach tworzenia wariantów genów i skriningu produktów ekspresji w ukierunkowanym procesie ewolucji .

Przegląd technik przygotowania bibliotek cDNA

Ekstrakcja DNA

W przypadku tworzenia biblioteki mRNA (tj. z klonami cDNA) istnieje kilka możliwych protokołów izolacji pełnej długości mRNA. Aby wyodrębnić DNA do bibliotek genomowego DNA (znanego również jako gDNA), przydatna może być mini-prep DNA.

Przygotuj wstawki

Biblioteki cDNA wymagają ostrożności, aby zapewnić, że pełnej długości klony mRNA są wychwycone jako cDNA (które później zostaną wstawione do wektorów). Z tego powodu zaprojektowano kilka protokołów w celu optymalizacji syntezy 1. nici cDNA i 2. nici cDNA, a także w celu zwiększenia prawdopodobieństwa kierunkowego klonowania do wektora.

Fragmenty gDNA są generowane z wyekstrahowanego gDNA przy użyciu niespecyficznych enzymów restrykcyjnych często przecinających.

Wektory

Sekwencje nukleotydowe będące przedmiotem zainteresowania są zachowane jako wstawki do plazmidu lub genomu bakteriofaga , który został użyty do zakażenia komórek bakteryjnych.

Wektory rozmnaża się najczęściej w komórkach bakteryjnych, ale jeśli stosuje się YAC (sztuczny chromosom drożdżowy), można użyć komórek drożdży. Wektory mogą być również propagowane w wirusach, ale może to być czasochłonne i żmudne. Jednak wysoka wydajność transfekcji uzyskiwana przy użyciu wirusów (często fagów) sprawia, że są one przydatne do pakowania wektora (z ligowaną wstawką), a następnie wprowadzania ich do komórki bakteryjnej (lub drożdżowej).

Dodatkowo dla bibliotek cDNA opracowano system wykorzystujący faga Lambda Zap II, ExAssist oraz 2 gatunki E. coli. Zamiast tego można również zastosować system Cre-Lox wykorzystujący miejsca loxP i ekspresję enzymu rekombinazy in vivo. Są to przykłady systemów wycinania in vivo. Wycięcie in vitro obejmuje subklonowanie, często przy użyciu tradycyjnych enzymów restrykcyjnych i strategii klonowania. Wycinanie in vitro może być bardziej czasochłonne i może wymagać więcej pracy „praktycznej” niż systemy wycinania in vivo. W obu przypadkach systemy umożliwiają przeniesienie wektora z faga do żywej komórki, gdzie wektor może się replikować i namnażać do momentu użycia biblioteki.

Korzystanie z bibliotek

Przebieg pracy do przeszukiwania biblioteki syntetycznej w celu identyfikacji komórek wytwarzających interesującą substancję chemiczną.

Obejmuje to „przeszukiwanie” sekwencji będących przedmiotem zainteresowania. Istnieje wiele możliwych metod osiągnięcia tego celu.

Linki zewnętrzne