Tasowanie DNA

Mutacje punktowe powodują zmiany pojedynczych nukleotydów, podczas gdy insercje i delecje skutkują odpowiednio dodaniem lub usunięciem nukleotydów. Tasowanie DNA umożliwia rekombinację genów rodzicielskich, co radykalnie zwiększa tempo ukierunkowanej ewolucji. Tasowanie DNA jest przydatne do generowania białek o nowych właściwościach lub kombinacjach pożądanych właściwości.

Tasowanie DNA , znane również jako hodowla molekularna, jest metodą losowej rekombinacji in vitro w celu wygenerowania zmutowanych genów do ukierunkowanej ewolucji i umożliwienia szybkiego zwiększenia rozmiaru biblioteki DNA . Trzy procedury przeprowadzania tasowania DNA to hodowla molekularna, która opiera się na rekombinacji homologicznej lub podobieństwie sekwencji DNA, enzymach restrykcyjnych , które opierają się na wspólnych miejscach restrykcyjnych , oraz niehomologicznej losowej rekombinacji, która wymaga użycia spinek do włosów . We wszystkich tych technikach geny rodzicielskie są fragmentowane, a następnie rekombinowane.

Tasowanie DNA wykorzystuje losową rekombinację w przeciwieństwie do mutagenezy ukierunkowanej w celu wytworzenia białek o unikalnych atrybutach lub kombinacjach pożądanych cech zakodowanych w genach macierzystych, takich jak termostabilność i wysoka aktywność. Potencjał tasowania DNA w celu wytworzenia nowych białek ilustruje rysunek pokazany po prawej stronie, który pokazuje różnicę między mutacjami punktowymi, insercjami i delecjami oraz tasowaniem DNA. W szczególności, ta figura pokazuje zastosowanie tasowania DNA w dwóch genach rodzicielskich, co umożliwia generowanie rekombinowanych białek, które mają losową kombinację sekwencji z każdego genu rodzicielskiego. Różni się to od mutacji punktowych , w których jeden nukleotyd został zmieniony, wstawiony lub usunięty, oraz insercji lub delecji, w których odpowiednio dodano lub usunięto sekwencję nukleotydów. W wyniku losowej rekombinacji tasowanie DNA jest w stanie wytworzyć białka o nowych właściwościach lub wielu korzystnych cechach pochodzących z genów macierzystych.

W 1994 roku Willem PC Stemmer opublikował pierwszy artykuł na temat tasowania DNA. Od czasu wprowadzenia tej techniki tasowanie DNA było stosowane w farmaceutykach białkowych i małocząsteczkowych, bioremediacji , szczepionkach , terapii genowej i wyewoluowanych wirusach. Inne techniki, które dają wyniki podobne do tasowania DNA, obejmują losową chimeragenezę na przejściowych matrycach (RACHITT), losowe drukowanie rekombinacji in vitro (RPR) i stopniowy proces wydłużania (StEP).

Historia

Tasowanie DNA przez hodowlę molekularną zostało po raz pierwszy opisane w 1994 roku przez Willema PC Stemmera. Rozpoczął od fragmentacji genu β-laktamazy , który został zamplifikowany w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu DNazy I , która losowo rozszczepia DNA. Następnie ukończył zmodyfikowaną reakcję PCR, w której starterów , co skutkowało hybrydyzacją fragmentów homologicznych lub fragmentów o podobnych sekwencjach. Na koniec fragmenty te amplifikowano metodą PCR. Stemmer poinformował, że zastosowanie tasowania DNA w połączeniu z krzyżowaniem wstecznym spowodowało wyeliminowanie nieistotnych mutacji i zwiększenie produkcji antybiotyku cefotaksymu . Podkreślił również potencjał ewolucji molekularnej z tasowaniem DNA. W szczególności wskazał, że technika może być wykorzystana do modyfikacji białek.

Tasowanie DNA zostało od tego czasu zastosowane do generowania bibliotek genów hybrydowych lub chimerycznych i zainspirowało tasowanie rodzin, które jest definiowane jako wykorzystanie pokrewnych genów w tasowaniu DNA. Ponadto tasowanie DNA zastosowano do farmaceutyków białkowych i małocząsteczkowych, bioremediacji, terapii genowej, szczepionek i wyewoluowanych wirusów.

Procedury

Hodowla molekularna

Po pierwsze, DNaza I jest stosowana do fragmentacji zestawu genów rodzicielskich na segmenty dwuniciowego DNA w zakresie od 10-50 bp do ponad 1 kbp. Następnie przeprowadza się PCR bez starterów. W reakcji PCR fragmenty DNA o dostatecznie zachodzących na siebie sekwencjach będą się łączyć ze sobą, a następnie wydłużać za pomocą polimerazy DNA . Wydłużenie PCR nie nastąpi, chyba że istnieją sekwencje DNA o wysokim podobieństwie. Ważnymi czynnikami wpływającymi na sekwencje syntetyzowane w tasowaniu DNA są polimeraza DNA, stężenia soli i temperatura hybrydyzacji. Na przykład zastosowanie polimerazy Taq do amplifikacji fragmentu o wielkości 1 kpz w reakcji PCR obejmującej 20 cykli daje od 33% do 98% produktów zawierających jedną lub więcej mutacji.

Do amplifikacji fragmentów można zastosować wiele cykli wydłużania PCR. Dodanie starterów, które mają być komplementarne do końców wydłużonych fragmentów, dodaje się w celu dalszej amplifikacji sekwencji za pomocą innego PCR. Startery można wybrać tak, aby miały dodatkowe sekwencje dodane na ich końcach 5', takie jak sekwencje miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne , które są potrzebne do ligacji z wektorem do klonowania .

Możliwe jest rekombinowanie części genów macierzystych w celu wytworzenia hybryd lub form chimerycznych o unikalnych właściwościach, stąd termin tasowanie DNA. Wadą hodowli molekularnej jest wymóg podobieństwa między sekwencjami, co zainspirowało rozwój innych procedur tasowania DNA.

Enzymy restrykcyjne

Enzymy restrykcyjne są wykorzystywane do fragmentacji genów macierzystych. Fragmenty są następnie łączone ze sobą poprzez ligację, którą można przeprowadzić za pomocą ligazy DNA . Na przykład, jeśli dwa geny rodzicielskie mają trzy miejsca restrykcyjne, można utworzyć czternaście różnych hybryd genów pełnej długości. O liczbie unikalnych hybryd pełnej długości decyduje fakt, że gen z trzema miejscami restrykcyjnymi można rozbić na cztery fragmenty . Tak więc istnieją dwie opcje dla każdej z czterech pozycji minus kombinacje, które odtworzyłyby dwa geny rodzicielskie dając 2 4 - 2 = 14 różnych genów hybrydowych pełnej długości .

Główna różnica między tasowaniem DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych a hodowlą molekularną polega na tym, że hodowla molekularna opiera się na homologii sekwencji hybrydyzacji nici i PCR w celu wydłużenia, podczas gdy przy użyciu enzymów restrykcyjnych powstają końce fragmentów, które można zligować. Do głównych zalet stosowania enzymów restrykcyjnych należy kontrola liczby zdarzeń rekombinacyjnych oraz brak wymogu amplifikacji PCR. Główną wadą jest wymóg posiadania wspólnych miejsc dla enzymów restrykcyjnych.

Niehomologiczna losowa rekombinacja

W celu wygenerowania segmentów w zakresie od 10-50 bp do ponad 1 kb, wykorzystuje się DNazę I. Końce fragmentów stępia się przez dodanie polimerazy DNA T4. Tępienie fragmentów jest ważne przy łączeniu fragmentów, ponieważ niekompatybilne lepkie końce lub nawisy uniemożliwiają łączenie końców. Następnie do mieszaniny fragmentów dodaje się spinki do włosów z określonym miejscem restrykcyjnym. Następnie stosuje się ligazę DNA T4 do ligacji fragmentów w celu utworzenia wydłużonych sekwencji. Ligacja spinek do włosów z fragmentami ogranicza długość przedłużonych sekwencji, zapobiegając dodaniu większej liczby fragmentów. Na koniec, w celu usunięcia pętli spinki do włosów, stosuje się enzym restrykcyjny.

Niehomologiczna losowa rekombinacja różni się od hodowli molekularnej tym, że homologia zligowanych sekwencji nie jest konieczna, co jest zaletą. Jednakże , ponieważ ten sposób polega na przypadkowej rekombinacji fragmentów, prawdopodobne jest, że duża część zrekombinowanych sekwencji DNA nie będzie miała pożądanych właściwości, co jest wadą. Niehomologiczna losowa rekombinacja różni się również od użycia enzymów restrykcyjnych do tasowania DNA, ponieważ nie są wymagane wspólne miejsca enzymów restrykcyjnych w genach macierzystych i konieczne jest użycie spinek do włosów, co pokazuje zalety i wady niehomologicznej losowej rekombinacji w porównaniu z użyciem enzymów restrykcyjnych, odpowiednio.

Aplikacje

Farmaceutyki białkowe i małocząsteczkowe

Ponieważ tasowanie DNA umożliwia rekombinację genów, można zwiększyć aktywność białek. Na przykład tasowanie DNA zastosowano do zwiększenia siły rekombinowanych interferonów prezentowanych na fagach w mysich i ludzkich komórkach. Dodatkowo, ulepszenie białka zielonej fluorescencji (GFP) osiągnięto poprzez tasowanie DNA przez hodowlę molekularną, ponieważ uzyskano 45-krotnie większy sygnał niż standard dla fluorescencji całej komórki. Ponadto synteza różnych genów może również prowadzić do produkcji białek o nowych właściwościach. Dlatego tasowanie DNA zostało wykorzystane do opracowania białek do detoksykacji chemikaliów. Na przykład metoda rekombinacji homologicznej tasowania DNA przez hodowlę molekularną została wykorzystana do zwiększenia detoksykacji atrazyny i arsenianu .

Bioremediacja

Tasowanie DNA zostało również wykorzystane do poprawy degradacji zanieczyszczeń biologicznych. Konkretnie, rekombinowany szczep E. coli został stworzony przy użyciu tasowania DNA poprzez hodowlę molekularną w celu bioremediacji trichloroetylenu ( TCE), potencjalnego czynnika rakotwórczego , który jest mniej podatny na toksyczne półprodukty epoksydowe.

Szczepionki

Zdolność do selekcji pożądanych rekombinantów z tasowaniem DNA została wykorzystana w połączeniu ze strategiami przesiewowymi w celu wzmocnienia kandydatów na szczepionki przeciwko infekcjom, z naciskiem na poprawę immunogenności , produkcji szczepionki, stabilności i reaktywności krzyżowej z wieloma szczepami patogenów. Zbadano niektóre potencjalne szczepionki przeciwko Plasmodium falciparum , wirusowi dengi , alfawirusom zapalenia mózgu (w tym: VEEV , WEEV i EEEV ), ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności-1 (HIV-1) i wirusowi zapalenia wątroby typu B (HBV).

Terapia genowa i ewoluujące wirusy

Wymagania dotyczące terapii genowych u ludzi obejmują wysoką czystość, wysokie miano i stabilność. Tasowanie DNA pozwala na wytwarzanie wektorów retrowirusowych o tych cechach. Na przykład tasowanie DNA z hodowlą molekularną zastosowano do sześciu ekotropowego wirusa mysiej białaczki (MLV), co zaowocowało kompilacją obszernej biblioteki rekombinowanych retrowirusów i identyfikacją wielu klonów o zwiększonej stabilności. Ponadto zastosowanie tasowania DNA poprzez hodowlę molekularną na wielu rodzicielskich wirusa związanego z adenowirusami (AAV) wykorzystano do wygenerowania biblioteki dziesięciu milionów chimer. Uzyskane korzystne cechy obejmują zwiększoną oporność na ludzką dożylną immunoglobulinę (IVIG) i wytwarzanie tropizmu komórkowego w nowych wirusach.

Porównanie z innymi technikami

Chociaż tasowanie DNA stało się użyteczną techniką losowej rekombinacji, w tym celu opracowano również inne metody, w tym RACHITT, RPR i StEP. Poniżej przedstawiono kilka zalet i wad tych innych metod rekombinacji.

RACHITT

W RACHITT fragmenty jednoniciowych (ss) genów rodzicielskich są przyłączane do matrycy ss, co skutkuje zmniejszeniem niedopasowania, co jest zaletą. Ponadto RACHIIT umożliwia rekombinację genów o niskim podobieństwie sekwencji. Jednak główną wadą jest przygotowanie fragmentów ss genów macierzystych i matrycy ss.

RPR

RPR wykorzystuje losowe startery. Te losowe startery są przyłączane do matrycy DNA, a następnie wydłużane fragmentem Klenowa . Następnie szablony są usuwane, a fragmenty są składane przez homologię w procesie podobnym do PCR. Niektóre główne korzyści obejmują mniejsze zapotrzebowanie na geny rodzicielskie dzięki zastosowaniu szablonów ss i zwiększonej różnorodności sekwencji przez błędne priming i błędne włączenie. Wadą RPR jest przygotowanie szablonu.

Krok

W StEP stosuje się krótkie cykle przyłączania starterów do matrycy i wydłużania przez polimerazę w celu wytworzenia sekwencji pełnej długości. Głównymi zaletami StEP są prostota metody i brak oczyszczania fragmentów. Wady StEP obejmują czasochłonność i wymaganie homologii sekwencji.

Zobacz też

  1. ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t u v w x y z aa ab ac ad ae af aga ai Glick    BR ​​(2017). Biotechnologia molekularna: zasady i zastosowania rekombinacji DNA . Cheryl L. Patten (wyd. Piąte). Waszyngton. ISBN 978-1-55581-936-1 . OCLC 975991667 .
  2. ^ ab Levi T, Sloutskin A, Kalifa R, Juven- Gershon    T, Gerlitz O (14.07.2020). „Wydajne wprowadzanie mutacji punktowych in vivo przy użyciu ssODN i podejścia Co-CRISPR” . Procedury biologiczne online . 22 (1): 14. doi : 10.1186/s12575-020-00123-7 . PMC 7362497 . PMID 32684853 .
  3. ^ a b c d e f g h i   Patten PA, Howard RJ, Stemmer WP (grudzień 1997). „Zastosowania tasowania DNA w farmaceutykach i szczepionkach”. Aktualna opinia w biotechnologii . 8 (6): 724–733. doi : 10.1016/S0958-1669(97)80127-9 . PMID 9425664 .
  4. ^ a b c d e f g h i j   Cirino PC, Qian S (1.01.2013), Zhao H (red.), „Rozdział 2 - Inżynieria białek jako narzędzie umożliwiające biologię syntetyczną” , Biologia syntetyczna , Boston : Prasa akademicka, s. 23–42, doi : 10.1016/b978-0-12-394430-6.00002-9 , ISBN 978-0-12-394430-6
  5. Bibliografia _ _ _   _ _ _ _ _ _ _ _ _ -385015-7
  6. Bibliografia   _ _ _ doi : 10.1533/9780857096760.2.95 , ISBN 978-0-85709-664-7
  7. ^ a b c d e f g h i j k l    Bioprzetwarzanie produktów o wartości dodanej z zasobów odnawialnych: nowe technologie i zastosowania . Shang-Tian Yang (wyd. 1). Amsterdam: Elsevier. 2007. ISBN 978-0-444-52114-9 . OCLC 162587118 . {{ cite book }} : CS1 maint: other ( link )
  8. ^ ab Arkin M (2001-01-01), „In vitro Mutagenesis”, w Brenner S, Miller   JH (red.), Encyclopedia of Genetics , New York: Academic Press, s. 1010–1014, doi : 10.1006 / rwgn.2001.0714 , ISBN 978-0-12-227080-2
  9. ^   Marshall SH (listopad 2002). „Tasowanie DNA: indukowana hodowla molekularna w celu wytworzenia długotrwałych szczepionek nowej generacji” . Postępy biotechnologii . 20 (3–4): 229–238. doi : 10.1016/s0734-9750(02)00015-0 . PMID 14550030 .
  10. ^ a b c d e   Locher CP, Paidhungat M, Whalen RG, Punnonen J (kwiecień 2005). „Strategie tasowania DNA i badań przesiewowych w celu poprawy skuteczności szczepionki”. Biologia DNA i komórki . 24 (4): 256–263. doi : 10.1089/dna.2005.24.256 . PMID 15812242 .
  11. ^ a b c d e    Powell SK, Kaloss MA, Pinkstaff A, McKee R, Burimski I, Pensiero M i in. (grudzień 2000). „Hodowla retrowirusów przez tasowanie DNA w celu poprawy stabilności i wydajności przetwarzania”. Biotechnologia przyrody . 18 (12): 1279–1282. doi : 10.1038/82391 . PMID 11101807 . S2CID 1865270 .
  12. ^ a b c d   Rui L, Kwon YM, Reardon KF, Wood TK (maj 2004). „Inżynieria szlaków metabolicznych w celu zwiększenia tlenowej degradacji chlorowanych etenów i zmniejszenia ich toksyczności poprzez klonowanie nowej S-transferazy glutationowej, wyewoluowanej o-monooksygenazy toluenu i syntetazy gamma-glutamylocysteiny”. Mikrobiologia Środowiskowa . 6 (5): 491–500. doi : 10.1111/j.1462-2920.2004.00586.x . PMID 15049922 .
  13. ^ a b c d e f g   Kurtzman AL, Govindarajan S, Vahle K, Jones JT, Heinrichs V, Patten PA (sierpień 2001). „Postępy w ukierunkowanej ewolucji białek poprzez rekurencyjną rekombinację genetyczną: zastosowania do białek terapeutycznych”. Aktualna opinia w biotechnologii . 12 (4): 361–370. doi : 10.1016/S0958-1669(00)00228-7 . PMID 11551464 .
  14. ^ a b c d e f g h i    Stemmer WP (sierpień 1994). „Szybka ewolucja białka in vitro przez tasowanie DNA”. Natura . 370 (6488): 389–391. Bibcode : 1994Natur.370..389S . doi : 10.1038/370389a0 . PMID 8047147 . S2CID 4363498 .
  15. ^ „DNaza I (wolna od RNazy) | NEB” . www.neb.com . Źródło 2021-10-30 .
  16. ^ a b c d e f    Stemmer WP (październik 1994). „Tasowanie DNA przez losową fragmentację i ponowne składanie: rekombinacja in vitro dla ewolucji molekularnej” . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 91 (22): 10747–10751. Bibcode : 1994PNAS...9110747S . doi : 10.1073/pnas.91.22.10747 . PMC45099 . _ PMID 7938023 .
  17. ^    Kikuchi M, Ohnishi K, Harayama S (2000-02-08). „Skuteczna metoda tasowania rodzin przy użyciu jednoniciowego DNA”. gen . 243 (1): 133–137. doi : 10.1016/S0378-1119(99)00547-8 . ISSN 0378-1119 . PMID 10675621 .
  18. ^    Crameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP (styczeń 1998). „Tasowanie DNA rodziny genów różnych gatunków przyspiesza ukierunkowaną ewolucję” . Natura . 391 (6664): 288–291. Bibcode : 1998Natur.391..288C . doi : 10.1038/34663 . PMID 9440693 . S2CID 4352696 .
  19. ^    Coco WM, Levinson WE, Crist MJ, Hektor HJ, Darzins A, Pienkos PT i in. (kwiecień 2001). „Metoda tasowania DNA do generowania wysoce zrekombinowanych genów i wyewoluowanych enzymów”. Biotechnologia przyrody . 19 (4): 354–359. doi : 10.1038/86744 . PMID 11283594 . S2CID 35360374 .
  20. ^ a b c    Crameri A, Whitehorn EA, Tate E, Stemmer WP (marzec 1996). „Ulepszone białko zielonej fluorescencji dzięki ewolucji molekularnej przy użyciu tasowania DNA”. Biotechnologia przyrody . 14 (3): 315–319. doi : 10.1038/nbt0396-315 . PMID 9630892 . S2CID 22803570 .
  21. ^ a b c d e f    Zhao H, Arnold FH (marzec 1997). „Optymalizacja tasowania DNA w celu uzyskania wysokiej wierności rekombinacji” . Badania kwasów nukleinowych . 25 (6): 1307–1308. doi : 10.1093/nar/25.6.1307 . PMC 146579 . PMID 9092645 .
  22. ^    Bacher JM, Reiss BD, Ellington AD (lipiec 2002). „Ewolucja antycypacyjna i tasowanie DNA” . Biologia genomu . 3 (8): RECENZJE1021. doi : 10.1186/gb-2002-3-8-reviews1021 . PMC 139397 . PMID 12186650 .
  23. ^    Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, Marillonnet S (14.05.2009). „Tasowanie Golden Gate: metoda tasowania DNA w jednym naczyniu oparta na enzymach restrykcyjnych typu II” . PLOS JEDEN . 4 (5): e5553. Bibcode : 2009PLoSO...4.5553E . doi : 10.1371/journal.pone.0005553 . PMC 2677662 . PMID 19436741 .
  24. ^ a b c d e    Bittker JA, Le BV, Liu JM, Liu DR (maj 2004). „Kierowana ewolucja enzymów białkowych przy użyciu niehomologicznej losowej rekombinacji” . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 101 (18): 7011–7016. Bibcode : 2004PNAS..101.7011B . doi : 10.1073/pnas.0402202101 . PMC 406457 . PMID 15118093 .
  25. ^    Zhu S, Peng A (czerwiec 2016). „Naprawa łączenia niehomologicznych końców w ekstrakcie z jaj Xenopus” . Raporty naukowe . 6 (1): 27797. Bibcode : 2016NatSR...627797Z . doi : 10.1038/srep27797 . PMC 4914968 . PMID 27324260 .
  26. ^    Ogiwara H, Kohno T (14.12.2011). „Zasadnicze czynniki łączenia niekompatybilnych końców DNA w pęknięciach podwójnej nici chromosomalnego DNA in vivo” . PLOS JEDEN . 6 (12): e28756. Bibcode : 2011PLoSO...628756O . doi : 10.1371/journal.pone.0028756 . PMC 3237495 . PMID 22194904 .
  27. ^ a b    Crameri A, Dawes G, Rodriguez E, Silver S, Stemmer WP (maj 1997). „Molekularna ewolucja szlaku detoksykacji arsenianu przez tasowanie DNA”. Biotechnologia przyrody . 15 (5): 436–438. doi : 10.1038/nbt0597-436 . PMID 9131621 . S2CID 25669058 .
  28. ^ a b    Kanada KA, Iwashita S, Shim H, Wood TK (styczeń 2002). „Kierowana ewolucja orto-monooksygenazy toluenu w celu zwiększenia syntezy 1-naftolu i degradacji chlorowanego etenu” . Journal of Bacteriology . 184 (2): 344–349. doi : 10.1128/JB.184.2.344-349.2002 . PMC 139589 . PMID 11751810 .
  29. ^ a b    Koerber JT, Jang JH, Schaffer DV (październik 2008). „Tasowanie DNA wirusa związanego z adenowirusami daje funkcjonalnie zróżnicowane wirusowe potomstwo” . Terapia molekularna . 16 (10): 1703–1709. doi : 10.1038/mt.2008.167 . PMC 2683895 . PMID 18728640 .
  30. ^ a b c d e    Esteban O, Woodyer RD, Zhao H (2003). „Rekombinacja DNA in vitro przez losowe primowanie”. W Arnold FH, Georgiou G (red.). Tworzenie biblioteki ukierunkowanej ewolucji . Metody w biologii molekularnej . Tom. 231. Totowa, NJ: Humana Press. s. 99–104. doi : 10.1385/1-59259-395-x:99 . ISBN 978-1-59259-395-8 . PMID 12824607 .
  31. ^    Zhao H, Giver L, Shao Z, Affholter JA, Arnold FH (marzec 1998). „Ewolucja molekularna w procesie rozłożonego wydłużania (StEP) rekombinacji in vitro”. Biotechnologia przyrody . 16 (3): 258–261. doi : 10.1038/nbt0398-258 . PMID 9528005 . S2CID 20490024 .
  32. ^    Aguinaldo AM, Arnold FH (2003). „Proces rozłożonego wydłużania (StEP) rekombinacji in vitro”. W Arnold FH, Georgiou G (red.). Tworzenie biblioteki ukierunkowanej ewolucji . Metody w biologii molekularnej . Tom. 231. Totowa, NJ: Humana Press. s. 105–110. doi : 10.1385/1-59259-395-X:105 . ISBN 978-1-59259-395-8 . PMID 12824608 .
Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=DNA_shuffling&oldid=1091108801 ”