biblioteka cDNA
Biblioteka cDNA jest kombinacją sklonowanych fragmentów cDNA ( komplementarnego DNA ) wprowadzonych do zbioru komórek gospodarza, które stanowią pewną część transkryptomu organizmu i są przechowywane jako „ biblioteka ”. cDNA jest wytwarzany z w pełni transkrybowanego mRNA znajdującego się w jądrze i dlatego zawiera tylko ekspresjonowane geny organizmu. Podobnie, można wytworzyć biblioteki cDNA swoiste dla tkanki. W eukariotycznych dojrzały mRNA jest już złożony , stąd wytworzony cDNA nie ma intronów i może być łatwo eksprymowany w komórce bakteryjnej. Podczas gdy informacje w bibliotekach cDNA są potężnym i użytecznym narzędziem, ponieważ produkty genów są łatwe do zidentyfikowania, w bibliotekach brakuje informacji o wzmacniaczach , intronach i innych elementach regulatorowych znajdujących się w bibliotece genomowego DNA .
Budowa biblioteki cDNA
cDNA powstaje z dojrzałego mRNA z komórki eukariotycznej przy pomocy odwrotnej transkryptazy . U eukariontów ogon poli-(A) (składający się z długiej sekwencji nukleotydów adeninowych) odróżnia mRNA od tRNA i rRNA i dlatego może być używany jako miejsce startowe do odwrotnej transkrypcji. Ma to problem polegający na tym, że nie wszystkie transkrypty, takie jak te dla histonu , kodują ogon poli-A .
ekstrakcja mRNA
Po pierwsze, należy wyizolować matrycę mRNA w celu stworzenia bibliotek cDNA. Ponieważ mRNA zawiera tylko eksony, należy wziąć pod uwagę integralność wyizolowanego mRNA, aby nadal można było wytwarzać kodowane białko. Wyizolowany mRNA powinien mieć wielkość od 500 bp do 8 kb. Istnieje kilka metod oczyszczania RNA, takich jak trizolem i oczyszczanie na kolumnie . Oczyszczanie na kolumnie można przeprowadzić przy użyciu żywic pokrytych oligomerycznymi nukleotydami dT, a cechy mRNA, takie jak posiadanie ogona poli-A, można wykorzystać tam, gdzie będą wiązać się tylko sekwencje mRNA zawierające tę cechę. Pożądany mRNA związany z kolumną jest następnie eluowany .
konstrukcja cDNA
Po oczyszczeniu mRNA starter oligo-dT (krótka sekwencja nukleotydów dezoksytymidynowych) jest wiązany z ogonem poli-A RNA. Starter jest wymagany do zainicjowania syntezy DNA przez enzym odwrotnej transkryptazy . Powoduje to tworzenie hybryd RNA-DNA, w których pojedyncza nić komplementarnego DNA jest związana z nicią mRNA. Aby usunąć mRNA, RNAza H jest używany do rozszczepienia szkieletu mRNA i wytworzenia wolnych grup 3'-OH, co jest ważne dla zastąpienia mRNA DNA. Następnie dodaje się polimerazę DNA I, przecięty RNA działa jak starter, dzięki któremu polimeraza DNA I może zidentyfikować i zainicjować wymianę nukleotydów RNA na nukleotydy DNA. Jest to zapewnione przez samo sscDNA poprzez zwinięcie się na samym końcu 3', tworząc pętlę spinki do włosów . Polimeraza wydłuża koniec 3'-OH, a później pętla na końcu 3' jest otwierana przez działanie nożycowe nukleazy S1 . Następnie stosuje się endonukleazy restrykcyjne i ligazę DNA do sklonowania sekwencji do plazmidów bakteryjnych .
Sklonowane bakterie są następnie selekcjonowane, zwykle poprzez selekcję antybiotykową. Po wybraniu tworzone są zapasy bakterii, które można później hodować i sekwencjonować w celu skompilowania biblioteki cDNA.
Zastosowania biblioteki cDNA
Biblioteki cDNA są powszechnie stosowane podczas reprodukcji genomów eukariotycznych, ponieważ ilość informacji jest zmniejszana w celu usunięcia dużej liczby regionów niekodujących z biblioteki. Biblioteki cDNA są wykorzystywane do ekspresji genów eukariotycznych u prokariotów. Prokarioty nie mają intronów w swoim DNA i dlatego nie posiadają żadnych enzymów, które mogłyby je wyciąć podczas procesu transkrypcji. cDNA nie ma intronów i dlatego może ulegać ekspresji w komórkach prokariotycznych. Biblioteki cDNA są najbardziej przydatne w genetyce odwrotnej , gdzie dodatkowe informacje genomowe są mniej przydatne. Ponadto biblioteki cDNA są często wykorzystywane w klonowaniu funkcjonalnym w celu identyfikacji genów na podstawie funkcji kodowanego białka. Podczas badania DNA eukariotycznego konstruowane są biblioteki ekspresyjne przy użyciu komplementarnego DNA (cDNA), aby upewnić się, że wstawka jest naprawdę genem.
Biblioteka cDNA a biblioteka genomowego DNA
W bibliotece cDNA brakuje elementów niekodujących i regulatorowych występujących w genomowym DNA. Biblioteki genomowego DNA dostarczają bardziej szczegółowych informacji o organizmie, ale ich generowanie i przechowywanie wymaga więcej zasobów.
Klonowanie cDNA
Cząsteczki cDNA można klonować za pomocą łączników miejsc restrykcyjnych. Łączniki to krótkie, dwuniciowe fragmenty DNA ( oligodeoksyrybonukleotyd ) o długości około 8 do 12 par nukleotydów, które zawierają miejsce cięcia endonukleazy restrykcyjnej , np. BamHI. Zarówno cDNA, jak i łącznik mają tępe końce, które można zligować razem przy użyciu ligazy DNA T4 o wysokim stężeniu. Następnie lepkie końce są wytwarzane w cząsteczce cDNA przez rozszczepianie końców cDNA (które mają teraz łączniki z wbudowanym miejscem) odpowiednią endonukleazą. Wektor do klonowania ( plazmid ) jest następnie cięty odpowiednią endonukleazą. Po ligacji „ lepkiego końca ” wstawki z wektorem, otrzymaną zrekombinowaną cząsteczkę DNA przenosi się do komórki gospodarza E. coli w celu klonowania.
Zobacz też
- ^ abc Ying , Shao- Yao (2004). „Komplementarne biblioteki DNA: przegląd” . Biotechnologia Molekularna . 27 (3): 245–252. doi : 10.1385/MB:27:3:245 . ISSN 1073-6085 . PMID 15247497 . S2CID 25600775 .
- ^ ab P., Clark, David (2009). Biotechnologia: zastosowanie rewolucji genetycznej . Pazdernik, Nanette Jean. Amsterdam: Academic Press/Elsevier. ISBN 9780121755522 . OCLC 226038060 .