Ciemny wygaszacz
Ciemny wygaszacz (znany również jako ciemny przyssawka ) to substancja, która pochłania energię wzbudzenia z fluoroforu i rozprasza ją w postaci ciepła ; podczas gdy typowy (fluorescencyjny) wygaszacz ponownie emituje większość tej energii w postaci światła . Ciemne wygaszacze są używane w biologii molekularnej w połączeniu z fluoroforami. Kiedy te dwa elementy są blisko siebie, na przykład w cząsteczce lub białku, emisja fluoroforu jest tłumiona. Efekt ten można wykorzystać do badania geometrii i ruchu molekularnego.
Przykładem jego zastosowania jest test TaqMan lub najeźdźcy, metody genotypowania SNP . Na przykład używana jest pętla spinki do włosów z fluoroforem i wygaszaczem u podstawy łodygi. Nieznakowany starter PCR specyficzny dla SNP (jeden z wielu) ze specyficznym ogonem 5' wiąże się z sekwencją, która ma być sondowana, a polimeraza Taq wydłuża sekwencję, która będzie miała specyficzny koniec 5' zależny od SNP (niewrażliwy na polimorfizmy powyżej omawiany SNP). W następnym biegu podkład , komplementarny do tego ogona, z pętelką spinki do włosów jest przedłużany. W następnym przebiegu wydłużenie komplementarnej nici spowoduje linearyzację spinki do włosów oddzielającej fluorofor i wygaszacz . Alternatywą dla stosowania wygaszaczy jest użycie FRET , gdzie połączenie dwóch barwników daje sygnał.
Tryb funkcji
Ciemne wygaszacze to barwniki bez natywnej fluorescencji . Do ostatnich kilku lat wygaszacze były zazwyczaj drugim barwnikiem fluorescencyjnym, na przykład fluoresceina jako reporter i tetrametylorodamina jako wygaszacz (sondy FAM/TAM). Jednak fluorescencja wygaszacza może zwiększyć szum tła z powodu nakładania się widm fluorescencji wygaszacza i reportera. To ograniczenie często wymusza stosowanie złożonej analizy danych i filtrów optycznych. Ciemne wygaszacze oferują rozwiązanie tego problemu, ponieważ nie zajmują pasma emisji. Ponadto ciemne wygaszacze umożliwiają multipleksowanie (gdy dwie lub więcej sond reporterowo-wygaszających jest używanych razem).
Barwniki fluorescencyjne pochłaniają światło, które wprowadza barwnik w stan wzbudzenia; barwnik powraca do stanu podstawowego ze stanu wzbudzonego emitując światło (fluorescencja). W układzie reporter – wygaszacz barwnik niepromieniująco (bez światła) przekazuje energię do wygaszacza. To przywraca barwnik do stanu podstawowego i generuje stan wzbudzony wygaszacza. Następnie wygaszacz powraca do stanu podstawowego poprzez zanik emisyjny ( fluorescencja ) lub bezpromieniotwórczy (wygaszanie ciemne). W rozpadzie niepromienistym lub ciemnym energia jest wydzielana poprzez wibracje molekularne (ciepło). Przy typowym μM lub mniejszym stężeniu próbki ciepło z rozpadu bezpromieniowego jest zbyt małe, aby wpłynąć na temperaturę roztworu.
Przykłady ciemnych wygaszaczy
- Dabsyl (kwas dimetyloaminoazobenzenosulfonowy) absorbuje w zielonym spektrum i jest często używany z fluoresceiną. (Dabsyl ma prawie identyczną absorpcję, ale zamiast estru sukcynoimidylowego zawiera chlorek sulfonylu , który tworzy bardziej stabilne koniugaty).
- Wygaszacze czarnych dziur są zdolne do wygaszania w całym widzialnym spektrum.
- Wygaszacze Qxl obejmują pełne spektrum widzialne.
- Iowa Black FQ absorbuje w zielono-żółtej części widma.
- Bloki Iowa Black RQ w pomarańczowo-czerwonej części widma.
- IRDye QC-1 gasi barwniki z zakresu widzialnego do bliskiej podczerwieni (500-900 nm).
Dalsza lektura
- J. Lakowicz, Zasady spektroskopii fluorescencyjnej , wyd. 2, Plenum, Nowy Jork, 1999 .
- Johansson, MK; Kucharz, RM (2003). „Dimery wewnątrzcząsteczkowe: nowa strategia projektowania sond wygaszanych fluorescencją”. chemia Eur. J. _ 9 (15): 3466–3471. doi : 10.1002/chem.200304941 . PMID 12898673 .