Dioksygenaza tlenku azotu
| dioksygenazy tlenku azotu | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
E. coli flawohemoglobina/NOD. zielony = domena reduktazy, niebieski = domena hemoglobiny.
| |||||||||
| Identyfikatory | |||||||||
| nr WE | 1.14.12.17 | ||||||||
| nr CAS | 214466-78-1 | ||||||||
| Bazy danych | |||||||||
| IntEnz | Widok IntEnz | ||||||||
| BRENDA | Wpis BRENDY | ||||||||
| ExPASy | Widok NiceZyme | ||||||||
| KEGG | Wpis KEGG | ||||||||
| MetaCyc | szlak metaboliczny | ||||||||
| PRYM | profil | ||||||||
| Struktury PDB | RCSB PDB PDBe PDB suma | ||||||||
| Ontologia genów | AmiGO / QuickGO | ||||||||
| |||||||||
Dioksygenaza tlenku azotu ( EC 1.14.12.17 ) jest enzymem , który katalizuje konwersję tlenku azotu (NO) do azotanu (NO
- 3 ) . Reakcję netto dla reakcji katalizowanej przez dioksygenazę tlenku azotu przedstawiono poniżej:
- 2NO + 2O 2 + NAD(P)H → 2NO 3 − + NAD(P) + + H +
Tlenek azotu jest wszechobecną małą cząsteczką, która bierze udział w wielu różnych procesach fizjologicznych, w tym w rozszerzaniu naczyń mięśni gładkich, dezagregacji płytek krwi, neuroprzekaźnictwie i odpowiedzi immunologicznej na infekcje bakteryjne. Nadprodukcja tej cząsteczki sygnałowej może być śmiertelna dla komórek poprzez zatrucie produkcji energii komórkowej. Najbardziej czułymi celami NO są akonitaza , enzym, który katalizuje izomeryzację cytrynianu do izocytrynianu w cyklu kwasu cytrynowego, oraz oksydaza cytochromowa , ostatni enzym w oddechowym łańcuchu transportu elektronów w mitochondriach. Dodatkowo NO, ze swoim samotnym rodnikiem na atomie azotu, bierze udział w wielu wtórnych mechanizmach toksyczności, w tym katalazy (co skutkuje toksycznością nadtlenku wodoru), uwalnianiu centrum żelaza Fe-S i tworzeniu kompleksów dinitozylowo-żelazowych.
Ze względu na potencjalną śmiertelność NO, komórki odniosły ogromne korzyści z ewolucji enzymu zdolnego do katalizowania konwersji toksycznego NO do azotanów. „Dioksygenaza tlenku azotu” jest enzymem zdolnym do przeprowadzenia tej reakcji. Dioksygenaza NO należy do rodziny oksydoreduktaz , a dokładniej działających na sparowanych donorów, z O2 jako utleniaczem iz włączeniem dwóch atomów tlenu do drugiego donora.
Mechanizm reakcji
Mechanizm działania nadal nie został całkowicie wydedukowany, jednak wiodąca teoria sugeruje, że konwersja odbywa się poprzez serię reakcji redoks z udziałem centrów żelaza, jak pokazano w serii reakcji połówkowych poniżej:
| Krok | Reakcja |
|---|---|
| Redukcja FAD | NAD(P)H + FAD + H + → NAD(P) + + FADH 2 |
| redukcja żelaza 1 | FADH 2 + Fe 3+ → Fe 2+ + FADH + H + |
| Redukcja żelaza 2 | FADH + Fe 3+ → FAD + Fe 2+ + H + |
| O 2 Wiązanie | Fe 2+ + O 2 → Fe 3+ (O 2 − ) |
| BRAK dioksygenacji | Fe 3+ (O 2 - ) + NIE → Fe 3 + + NIE 3 - |
Inna teoria opracowana niedawno (2009) sugeruje, że aktywność dioksygenazy NO może również zachodzić poprzez nitrowanie fenolowe poprzez domniemany związek pośredni hem-peroksyazotyn.
Najlepiej zbadaną dioksygenazą NO jest flawohemoglobina (flavoHb), pokazana po prawej stronie: Badania wykazały, że flawohemoglobiny są indukowane przez NO, azotyny, azotany i czynniki uwalniające NO u różnych bakterii i grzybów. Ponadto wykazano, że flawoHbs chronią bakterie, drożdże i Dictyostelium discoideum przed zahamowaniem wzrostu i uszkodzeniami, w których pośredniczy NO.
Odkrycie
Dioksygenaza tlenku azotu została odkryta i po raz pierwszy opisana w 1998 roku jako indukowalna aktywność enzymatyczna zależna od O2, która chroni bakterie przed toksycznością tlenku azotu . Enzym zidentyfikowano za pomocą flawohemoglobiny E. coli .
Niedawno zidentyfikowano inne białko jako dioksygenazę NO - rhodobacter sphaeroides hem protein (SHP), nowy cytochrom o aktywności dioksygenazy NO. Chociaż funkcja biologiczna SHP nie została jeszcze zidentyfikowana, wykazano, że SHP po związaniu tlenu może szybko reagować z tlenkiem azotu, tworząc azotany.
Struktura i funkcja molekularna
Białko flawohemoglobiny zawiera dwie domeny: domenę wiążącą oksydoreduktazę FAD i domenę „ globiny ” zawierającą hem typu b i opcjonalnie domenę wiążącą oksydoreduktazę NAD . Domena reduktazy dostarcza elektron do żelaza hemowego, aby osiągnąć wysoką szybkość katalitycznego dioksygenacji NO. Oprócz licznych flawohemoglobin, wielu daleko spokrewnionych członków nadrodziny hemoglobiny , w tym mioglobina mięśniowa , niesymbiotyczna hemoglobina roślinna i symbiotyczna leghemoglobina roślinna , że neuronalna neuroglobina i ssacza cytoplazmatyczna cytoglobina działają jako dioksygenazy tlenku azotu (NOD), chociaż komórkowy donor elektronów dla wielu globin nie został jeszcze zdefiniowany. Donorami elektronów mogą być askorbinian, cytochrom b 5 lub reduktaza ferredoksyny. Katalityczne odtlenianie NO można zapisać w najprostszej postaci:
- NIE + O 2 + mi - NIE 3 -
Kataliza jest bardzo wydajna. Podane stałe szybkości dwucząsteczkowego dioksygenacji NO mieszczą się w zakresie od 2 x 10 7 M -1 s -1 dla cytoglobiny do 3 x 10 9 M -1 s -1 dla flawohemoglobiny, a szybkości obrotu wahają się od 1 do 700 s -1 . Struktura, wiązanie O2 i redukcja globin wydają się zoptymalizowane pod kątem funkcji dioksygenazy NO.
Funkcja fizjologiczna
Historycznie rzecz biorąc, dioksygenaza tlenku azotu (około 1,8 miliarda lat temu) służyła jako współczesny odpowiednik funkcji hemoglobiny / mioglobiny do przechowywania i transportu tlenu. Gardnera i in. (1998) zasugerowali, że pierwsza hemoglobina/mioglobina prawdopodobnie działała jako enzym wykorzystujący związany „aktywowany” gazowy tlen do dioksygenacji NO w drobnoustrojach.
Szeroka różnorodność organizmów wielokomórkowych korzystających z funkcji magazynowania i transportu tlenu przez mioglobinę/hemoglobinę pojawiła się znacznie później (około 0,5 miliarda lat temu).
Obecnie wiadomo, że NOD pełnią dwie ważne funkcje fizjologiczne w różnych formach życia: zapobiegają toksyczności NO (inaczej zwanej „stresem nitrozacyjnym”) i regulują sygnalizację NO. NOD należą do większej rodziny dobrze ugruntowanych enzymów odtruwających wolne rodniki i reaktywny tlen, która obejmuje dysmutazę ponadtlenkową , katalazę i peroksydazę .
Dystrybucja w przyrodzie
NOD, jak również wiele hemoglobin, które działają jako NOD, są rozprowadzane do większości form życia, w tym bakterii, grzybów, protistów, robaków, roślin i zwierząt. W rzeczywistości dioksygenacja tlenku azotu wydaje się być pierwotną funkcją członków nadrodziny hemoglobiny. Co więcej, staje się coraz bardziej oczywiste, że funkcja NOD globin jest znacznie bardziej powszechna niż paradygmatyczna funkcja transportu-magazynowania O2 hemoglobiny w krwinkach czerwonych , która została po raz pierwszy zbadana i opisana ponad sto lat wcześniej przez Felixa Hoppe-Seylera i inni. Inne białka, które mogą działać jako NOD, obejmują ssaczy mikrosomalny cytochrom P450(s) i nowy cytochrom b wiążący O2 z Rhodobacter sphaeroides .
Technologie
Inhibitory NOD są opracowywane do zastosowania jako antybiotyki bakteryjne, środki przeciwnowotworowe i modulatory sygnalizacji NO. Najbardziej znaną jak dotąd klasą inhibitorów dioksygenazy NO są imidazolowe . Wykazano, że imidazole koordynują z hemowym atomem żelaza mikrobiologicznej flawohemoglobiny, upośledzają redukcję hemu żelazowego, powodują niekonkurencyjne hamowanie względem O2 i NO oraz hamują metabolizm NO przez drożdże i bakterie. W szczególności wykazano, że imidazole zawierające duże podstawniki aromatyczne mają potencjał do selektywnego i wysokiego powinowactwa hamowania funkcji dioksygenazy NO poprzez koordynację katalitycznego żelaza hemowego i „dopasowanie” do dużej hydrofobowej dystalnej kieszeni hemowej. W rezultacie zasugerowano, że inżynieria imidazolu jest sposobem na specyficzne hamowanie dioksygenaz NO.
Ponadto opracowywane są genetycznie modyfikowane rośliny z heterologicznymi flawohemoglobinami-NOD w celu ograniczenia toksyczności NO powstającej w wyniku metabolizmu nawozów azotowych przez drobnoustroje glebowe oraz jako środek do samozapłodnienia roślin poprzez absorpcję środowiskowego NO.
opisano wektor lentiwirusowy, który umożliwia ekspresję E. coli flavoHb w komórkach ssaków. Podejście to wykazało, że flawoHb jest rzeczywiście aktywny enzymatycznie w komórkach ludzkich i mysich i silnie blokuje egzogenne i endogenne źródła stresu nitrozacyjnego. Technologia ta została następnie rozszerzona, aby zbadać rolę syntezy NO w wysoce rakotwórczych komórkach macierzystych raka (CSC) z ludzkiego glejaka (guza mózgu). Ekspresja flawoHb w ksenoprzeszczepach guzów doprowadziła do wyczerpania NO wytwarzanego przez iNOS/NOS2. Wynikiem fenotypowym była utrata rakotwórczości CSC i poprawa przeżywalności myszy. Eksperymenty te pokazują, że flawoHb można wykorzystać do in vivo biologii tlenku azotu i sugerują, że terapeutyczne zmniejszenie ilości NO można osiągnąć poprzez heterologiczną ekspresję bakteryjnych flawoHb.
