Fotostymulacja
Fotostymulacja to wykorzystanie światła do sztucznej aktywacji związków biologicznych, komórek , tkanek , a nawet całych organizmów . Fotostymulację można wykorzystać do nieinwazyjnego badania różnych zależności między różnymi procesami biologicznymi, używając tylko światła. W dłuższej perspektywie fotostymulacja ma potencjał do zastosowania w różnych typach terapii, takich jak migrenowy ból głowy . Dodatkowo fotostymulacja może być wykorzystana do mapowania połączeń neuronalnych między różnymi obszarami mózgu poprzez „odblokowywanie” biomolekuł sygnalizacyjnych za pomocą światła. Terapię fotostymulacją nazwano terapią światłem , fototerapią lub fotobiomodulacją.
Metody fotostymulacji dzielą się na dwie ogólne kategorie: jeden zestaw metod wykorzystuje światło do uwolnienia związku, który następnie staje się aktywny biochemicznie, wiążąc się z efektorem znajdującym się dalej. Na przykład glutaminian z odpakowywania jest przydatny do znajdowania połączeń pobudzających między neuronami, ponieważ glutaminian odblokowywany naśladuje naturalną aktywność synaptyczną jednego neuronu uderzającego w drugi. Inną główną metodą fotostymulacji jest użycie światła do aktywacji światłoczułego białka, takiego jak rodopsyna , które może następnie pobudzić komórkę wyrażającą opsynę.
Naukowcy od dawna postulowali potrzebę kontrolowania jednego typu komórek, pozostawiając otaczające go nietknięte i niestymulowane. Dobrze znane postępy naukowe, takie jak stosowanie bodźców elektrycznych i elektrod, odniosły sukces w aktywacji neuronów, ale nie osiągnęły wspomnianego celu z powodu ich niedokładności i niezdolności do rozróżnienia różnych typów komórek. Zastosowanie optogenetyki (sztucznej aktywacji komórek za pomocą bodźców świetlnych) jest wyjątkowe pod względem zdolności do dostarczania impulsów świetlnych w precyzyjny i terminowy sposób. Optogenetyka jest nieco dwukierunkowa w swojej zdolności do kontrolowania neuronów. Kanały mogą być zdepolaryzowane lub hiperpolaryzowane w zależności od długości fali światła, które jest na nie skierowane. Na przykład technikę tę można zastosować do kanałowych kanałów kationowych rodopsyny w celu zainicjowania depolaryzacji neuronów i ostatecznie aktywacji po oświetleniu. I odwrotnie, hamowanie aktywności neuronu można wywołać za pomocą optogenetyki, jak w przypadku pompy chlorkowej halorodopsyny, która działa w celu hiperpolaryzacji neuronów.
Jednak zanim będzie można przeprowadzić optogenetykę, badany musi wyrazić docelowe kanały. Naturalne i bogate w mikroorganizmy rodopsyny - w tym bakteriorodopsyna, halorodopsyna i rodopsyna kanałowa - mają różne charakterystyczne spektrum działania, które opisuje zestaw kolorów i długości fal, na które reagują i dzięki którym działają.
Wykazano, że kanałowa rodopsyna-2 , monolityczne białko zawierające czujnik światła i kanał kationowy, zapewnia stymulację elektryczną o odpowiedniej szybkości i wielkości, aby aktywować impulsy neuronalne. Ostatnio fotoinhibicja , hamowanie aktywności nerwowej za pomocą światła, stało się wykonalne dzięki zastosowaniu cząsteczek, takich jak aktywowana światłem chlorkowa pompa halorodopsyna, do kontroli neuronalnej. Razem rodopsyna kanałowa aktywowana światłem niebieskim i halorodopsyna aktywowana światłem żółtym umożliwiają wielokolorową, optyczną aktywację i wyciszenie aktywności neuronów. (Zobacz także Fotobiomodulacja )
Metody
Białko w klatce to białko, które jest aktywowane w obecności stymulującego źródła światła. W większości przypadków fotousuwanie jest techniką ujawniającą aktywny region związku w procesie fotolizy cząsteczki ekranującej („klatki”). Jednak uwolnienie białka wymaga odpowiedniej długości fali, intensywności i czasu naświetlania . Osiągnięcie tego jest możliwe dzięki temu, że światłowód mogą być modyfikowane w celu dostarczania określonych ilości światła. Ponadto krótkie impulsy stymulacji pozwalają na uzyskanie wyników zbliżonych do normy fizjologicznej. Etapy fotostymulacji są niezależne od czasu, ponieważ dostarczanie białka i aktywacja światła mogą odbywać się w różnym czasie. Dzieje się tak, ponieważ te dwa etapy są od siebie zależne w celu aktywacji białka.
Niektóre białka są z natury światłoczułe i działają w obecności światła. Białka znane jako opsyny stanowią sedno białek światłoczułych. Białka te często znajdują się w oku. Ponadto wiele z tych białek działa jako kanały jonowe i receptory . Jednym z przykładów jest umieszczenie określonej długości fali światła na określonych kanałach, blokada w porach zostaje złagodzona i umożliwia transdukcję jonów.
Aby odblokować cząsteczki, wymagany jest system fotolizy do rozerwania wiązania kowalencyjnego . Przykładowy system może składać się ze źródła światła (zazwyczaj lasera lub lampy), regulatora ilości wpadającego światła, prowadnicy światła i systemu dostarczania. Często konstrukcja działa w taki sposób, że pomiędzy rozpraszającym światłem spotyka się medium, które może powodować dodatkową, niechcianą fotolizę i tłumienie światła; oba są poważnymi problemami z systemem fotolizy.
Historia
Idea fotostymulacji jako metody kontrolowania funkcji biomolekuł powstała w latach 70. XX wieku. Dwóch naukowców, Walther Stoeckenius i Dieter Oesterhelt, odkryło pompę jonową znaną jako bakteriorodopsyna który funkcjonuje w obecności światła w 1971 roku. W 1978 roku JF Hoffman wynalazł termin „klatka”. Niestety, termin ten wywołał pewne zamieszanie wśród naukowców ze względu na fakt, że termin ten jest często używany do opisania cząsteczki uwięzionej w innej cząsteczce. Można go również pomylić z „efektem klatki” w rekombinacji rodników. Dlatego niektórzy autorzy postanowili użyć terminu „aktywowany światłem” zamiast „klatki”. Oba terminy są obecnie w użyciu. Pierwsza „cząsteczka w klatce” zsyntetyzowana przez Hoffmana i in. w Yale był zamkniętym prekursorem ATP 1.
Aplikacje
Fotostymulacja wyróżnia się precyzją czasową, którą można wykorzystać do uzyskania dokładnego czasu rozpoczęcia aktywacji efektorów w klatkach. W połączeniu z inhibitorami w klatkach można badać rolę biomolekuł w określonych punktach czasowych cyklu życiowego organizmu. Klatkowy inhibitor białka fuzyjnego wrażliwego na N-etylomaleimid (NSF), kluczowego mediatora transmisji synaptycznej, został wykorzystany do zbadania zależności NSF od czasu. Kilka innych badań miało wpływ na potencjał czynnościowy odpalanie poprzez użycie neuroprzekaźników w klatkach, takich jak glutaminian. Neuroprzekaźniki w klatkach, w tym fotolabilne prekursory glutaminianu , dopaminy , serotoniny i GABA , są dostępne w handlu.
Sygnalizacja podczas mitozy była badana przy użyciu cząsteczek reporterowych z fluoroforem w klatce , który nie jest fosforylowany, jeśli nie zachodzi fotoliza. Zaletą tej techniki jest to, że zapewnia „migawkę” kinazy w określonych punktach czasowych, zamiast rejestrować całą aktywność od wprowadzenia reportera.
wapnia odgrywają ważną rolę sygnalizacyjną, a kontrolowanie ich uwalniania za pomocą kanałów w klatkach było szeroko badane.
Niestety, nie wszystkie organizmy wytwarzają lub przechowują wystarczające ilości opsyny. Zatem gen opsyny musi zostać wprowadzony do docelowych neuronów, jeśli nie są one już obecne w badanym organizmie. Dodatek i ekspresja tego genu jest wystarczająca do wykorzystania w optogenetyce. Możliwe sposoby osiągnięcia tego obejmują konstrukcję linii transgenicznych zawierających gen lub ostry transfer genu do określonego obszaru lub regionu w obrębie osobnika. Metody te są znane odpowiednio jako transgeneza linii zarodkowej i dostarczanie genów somatycznych.
Optogenetyka okazała się bardzo obiecująca w leczeniu szeregu zaburzeń neurologicznych, takich jak choroba Parkinsona i epilepsja. Optogenetyka może ułatwić manipulację i celowanie w określone typy komórek lub obwody nerwowe, cechy, których brakuje w obecnych technikach stymulacji mózgu, takich jak DBS. W tym momencie zastosowanie optogenetyki w leczeniu chorób nerwowych zostało praktycznie wdrożone w dziedzinie neurobiologii dopiero po to, aby ujawnić więcej o mechanizmach określonych zaburzeń. Zanim technika będzie mogła zostać wdrożona do bezpośredniego leczenia tych zaburzeń, rozwój innych pokrewnych dziedzin, takich jak terapia genowa, inżynieria opsynowa i optoelektronika, musi również dokonać pewnych zmian.