KaiB

Identyfikatory
KaiB
Organizm	Synechococcus elongatus
Symbol	kaiB
Entrez	31251
RefSeq (mRNA)	NM_080317
RefSeq (Prot)	NP_525056
UniProt	P07663
Inne dane
Chromosom	X: 2,58 - 2,59 MB
Szukaj Struktury Model szwajcarski Domeny InterPro

KaiB to gen zlokalizowany w wysoce konserwatywnym klastrze genów kaiABC różnych gatunków sinic . Wraz z KaiA i KaiC , KaiB odgrywa kluczową rolę w działaniu zegara okołodobowego cyjanobakterii. Odkrycie genów Kai oznaczało pierwszą w historii identyfikację oscylatora okołodobowego u gatunku prokariotycznego . Co więcej, charakterystyka zegara sinicowego wykazała istnienie niezależnych od transkrypcji, potranslacyjnych mechanizmów generowania rytmu, kwestionując uniwersalność modelu rytmiczności okołodobowej opartego na sprzężeniu zwrotnym transkrypcja-translacja.

Odkrycie

Prokariotyczne rytmy okołodobowe

Rytmy dobowe – endogenne, możliwe do porywania oscylacje w procesach biologicznych z okresami mniej więcej odpowiadającymi 24-godzinnej dobie – kiedyś uważano za wyłączną właściwość eukariotycznych form życia. Uważano, że prokariontom brakuje złożoności komórkowej, aby utrzymać trwały pomiar czasu z kompensacją temperatury. Ponadto szeroko wspierany program „circadian- infradian reguła” stanowiła, że ​​funkcje komórkowe mogą być sprzężone z oscylatorem okołodobowym tylko w komórkach dzielących się tylko tak szybko, jak raz na 24 godziny. Prokarionty, które często przechodzą podziały komórkowe wiele razy w ciągu jednego dnia, nie spełniły tego warunku.

Z biegiem czasu coraz więcej dowodów zaczęło kwestionować to twierdzenie i potwierdzało istnienie bakteryjnego rytmu dobowego . Na przykład dyskretna czasowa separacja fotosyntezy i wiązania azotu obserwowana u sinic sugeruje istnienie pewnego mechanizmu kontroli okołodobowej. Wreszcie w 1986 roku Tan-Chi Huang i współpracownicy odkryli i scharakteryzowali silne, 24-godzinne rytmy wiązania azotu u Synechococcus cyjanobakterii, wykazując rytmikę okołodobową u gatunku prokariotycznego. Po tych odkryciach chronobiolodzy postanowili zidentyfikować molekularne mechanizmy rządzące działaniem zegara sinicowego.

Odkrycie zegara sinicowego

Takao Kondo , Carl Johnson i Susan Golden użyli lucyferazy bakteryjnej , reportera ekspresji genów, na genie psbAI , aby monitorować aktywność tego genu zegarowego występującego w sinicach Synechococcus . Transformacja 44-godzinnego mutanta zegara o długim okresie, C44a , biblioteką genomowego DNA typu dzikiego (WT) w wektorze plazmidowym umożliwiła testowanie „klonów ratunkowych” z normalnym okresem 25 godzin. Kiedy bibliotekę DNA z tego uratowanego klonu umieszczono w plazmidzie w oryginalnym miejscu, C44a okazało się, że został całkowicie uratowany. Stwierdzono , że pojedynczy klaster genów, kaiABC , ma charakter rytmiczny, gdy zsekwencjonowano fragment plazmidu odpowiedzialny za ratunek. kaiABC składa się z trzech pojedynczych genów: kaiA , kaiB i kaiC . Badanie wzorców ratunkowych u ponad 50 mutantów zegara wykazujących krótkie okresy, długie okresy lub arytmię ujawniło przywrócenie fenotypu WT u wszystkich mutantów. Dalsze sekwencjonowanie ujawniło łącznie 19 dla kaiABC , z których 14 miało mutacje w kaiC , 3 w kaiA i 2 w kaiB . Wszystkie zmutowane fenotypy spowodowane pojedynczą substytucją aminokwasu w jednym z wyżej wymienionych genów wykazały, że białka Kai odgrywają znaczącą rolę w zegarze okołodobowym Synechococcus .

Początkowo sądzono, że pętla sprzężenia zwrotnego transkrypcja-translacja jest niezbędna do tworzenia rytmów okołodobowych, więc wierzono, że kaiABC również będzie pełnić tę funkcję. Jednak później odkryto, że hamowanie kaiBC za pomocą inhibitora transkrypcji lub translacji nie zapobiegło okołodobowemu cyklowi fosforylacji kaiC. Tak więc jest tak, że rytmiczność zegara cyjanobakterii jest niezależna zarówno od transkrypcji, jak i translacji. Dodatkowo przeprowadzono eksperymenty mające na celu przetestowanie samopodtrzymującej się oscylacji fosforylacji KaiC, która jest ważna w regulacji klaster genów kaiABC . Poprzez inkubację KaiC razem z KaiA i KaiB, a także ATP, udowodniono aspekt kompensacji temperatury zegara KaiABC. Ponadto takie okresy okołodobowe obserwowane w mutantach kaiC in vivo obserwowano również w szczepach in vitro .

Historia ewolucyjna

Cyjanobakterie to grupa fotosyntetycznych bakterii wiążących azot, o których wiadomo, że są jedną z pierwszych form życia na Ziemi i uważa się, że pojawiły się co najmniej 3500 milionów lat temu (Mya). Są jedynymi znanymi oksydacyjnymi fotosyntetyzującymi prokariotami. Cyjanobakterie wykorzystują zegary okołodobowe do regulowania wiązania azotu, podziału komórek i innych procesów metabolicznych. Zdecydowana większość genów cyjanobakterii ulega ekspresji w sposób okołodobowy, ogólnie należąc do kategorii klasy I (szczyt zmierzchu) i klasy II (szczyt szczytu świtu), w zależności od ich specyficznej funkcji.

Rytmiczna ekspresja genów cyjanobakterii jest napędzana przez oscylację stanu fosforylacji oscylatora Kai i jego interakcję z różnymi mechanizmami wyjściowymi. Ewolucja trzech kai – kaiA , kaiB i kaiC – pozostaje obszarem aktywnych badań. Niedawne dowody filogenetyczne sugerują, że kai pojawiały się sekwencyjnie: kaiC prawie 3800 Mya, kaiB między 3500-23200 Mya, a ostatnio kaiA około 1000 Mya. Fuzja kaiC i kaiB w operon pod kontrolą pojedynczego promotora nastąpiło wkrótce po pojawieniu się kaiB w genomie.

Podczas gdy wszystkie trzy geny kai są niezależnie wymagane do utrzymania rytmiki okołodobowej u cyjanobakterii, gen kaiA jest ograniczony do grupy cyjanobakterii wyższego rzędu. Na przykład, podczas gdy Synechococcus i Prochlorococcus są blisko spokrewnione, kaiA nie występuje w gatunkach Prochlorococcus . Cyjanobakterie pozbawione kaiA wykazują oscylacje w ekspresji genów i progresji cyklu komórkowego, ale te rytmy nie są samopodtrzymujące się i szybko zanikają w stałych warunkach.

Kontrastujące gatunki cyjanobakterii pozbawione genów kai , niektórzy członkowie rodziny Synechococcus wyrażają paralogi kaiB i kaiC określane jako kaiC2 , kaiB2 , kaiC3 i kaiB3 . Funkcja tego rozszerzonego zestawu genów zegara pozostaje spekulacyjna, ale obecne dowody sugerują, że te paralogi pomagają dostroić centralny rytm okołodobowy ustanowiony przez kaiA , kaiB1 i kaiC1 .

Archaea i Pseudomonadota zidentyfikowano ortologi genów kaiB i kaiC . Prawdopodobnie wywodzące się z transferu bocznego, niektóre z tych ortologów - szczególnie w przypadkach, gdy kaiB i kaiC są zbieżne - zostały wstępnie uwikłane w podstawowe mechanizmy mierzenia czasu. Inne odgrywają role w uderzająco rozbieżnych procesach komórkowych, takich jak reakcje oksydacyjne i solne wywołane przez bakterie Legionella pneumophila .

Funkcjonować

Rola w zegarze okołodobowym

Rdzeń cyjanobakteryjnego oscylatora okołodobowego, kodowany przez geny kaiA , kaiB i kaiC , reguluje globalne wzorce ekspresji genów i reguluje podstawowe procesy komórkowe, w tym fotosyntezę i podział komórek. Cykliczne, sekwencyjne rytmy fosforylacji i defosforylacji KaiC stanowią mechanizm pomiaru czasu oscylatora zarówno in vivo, jak i in vitro .

KaiC jest zorganizowany jako homoheksamer w kształcie pierścienia. Każdy składnik monomerowy zawiera cztery podstawowe motywy strukturalne: domenę CI, domenę CII, domenę wiążącą pętlę B i ogon wystający z C-końca, znany jako pętla A. Ponieważ domeny CI i CII są wyrównane w heksamerze KaiC, są one wspólnie określane jako pierścienie CI i CII. KaiC ma zarówno wewnętrzną aktywność autokinazy, jak i autofosforanu, z których każda może być modulowana przez wiązanie KaiA i KaiB. W szczególności fosforylacja i defosforylacja reszt Ser431 i Thr432 w pierścieniu CII napędza rytmy okołodobowe w oscylatorze Kai.

Na początku subiektywnego dnia reszty Ser431 i Thr432 heksameru KaiC są niefosforylowane, a domeny pętli A jego składowych monomerów są odsłonięte. KaiA wiąże się z domeną pętli A KaiC, promując aktywność autokinazy. Fosforylacja białka zachodzi w uporządkowany, sekwencyjny sposób – najpierw fosforyluje się Thr432, a następnie Ser431. Fosforylacja reszty Ser431 powoduje znaczącą zmianę konformacyjną w heksamerze KaiC. Pierścienie CI i CII kompleksu białkowego układają się ściślej, odsłaniając wcześniej zamkniętą pętlę B. Pętla B z kolei rekrutuje KaiB, który jednocześnie wiąże się z KaiA i KaiC. Wiązanie KaiB usuwa KaiA z pętli A, co z kolei zarówno promuje aktywność autofosfatazy KaiC, jak i hamuje jej aktywność autokinazy. Defosforylacja KaiC zachodzi w subiektywnej nocy i przebiega w odwrotnej kolejności niż fosforylacja; Thr432 jest defosforylowany przed Ser431.

Ostatecznie te rytmy okołodobowe w fosforylacji KaiC, zarządzane przez wiązanie KaiA i KaiB, tworzą oscylator potranslacyjny, który może wchodzić w interakcje z obydwoma szlakami wejściowymi w celu porywania do zmieniających się warunków środowiskowych i szlaków wyjściowych w celu pośredniczenia w zdarzeniach transkrypcyjnych.

Cykliczne rytmy fosforylacji heksameru KaiC służą jako mechanizm pomiaru czasu dla cyjanobakteryjnego oscylatora Kai. Kółka zacieniowane na czerwono reprezentują reszty fosforylowane.

Wyjścia okołodobowe i przełączanie fałd KaiB

Chociaż oscylator Kai jest w stanie generować endogenne rytmy fosforylacji, nie wpływa bezpośrednio na ekspresję genów; żadne z białek Kai nie posiada domen wiążących DNA. Zamiast tego dwuskładnikowy system składający się z SasA, kinazy histydynowej i RpaA, czynnika transkrypcyjnego, łączy zmiany w fosforylacji KaiC ze zdarzeniami transkrypcyjnymi.

SasA może wiązać się z odsłoniętą pętlą B cząsteczki KaiC po fosforylacji reszty Ser431. Ta interakcja napędza autofosforylację SasA, a następnie fosfotransfer do RpaA. Phospho-RpaA aktywuje ekspresję genów szczytu zmierzchu (klasa 1) i tłumi ekspresję genów szczytu świtu (klasa 2). I odwrotnie, niefosforylowany RpaA hamuje ekspresję genów klasy 1. W rezultacie rytmiczna fosforylacja czynnika transkrypcyjnego, napędzana przez oscylator Kai i związaną z nim aktywność SasA, wytwarza rytmiczne wzorce w ekspresji genów.

KaiB służy jako główny regulator szlaku SasA-RpaA i wykazuje adaptacje strukturalne, które zarówno przyczyniają się do generowania rytmu dobowego, jak i ułatwiają interakcję z SasA i KaiC. Większość KaiB wyrażona w sinicach istnieje jako nieaktywny homotetramer, niezdolny do interakcji z KaiC. Tetramer KaiB istnieje w równowadze z monomeryczną formą białka. Jednak monomeryczny KaiB musi przejść radykalną zmianę w strukturze trzeciorzędowej, aby związać się z KaiC, przechodząc od tak zwanej konformacji stanu podstawowego (gs-KaiB) do konformacji przełączanej fałdami (fs-KaiB) zdolnej do wiązania się z KaiC B- pętla. Jak dotąd KaiB jest jedynym znanym metamorficznym białkiem zegarowym – klasą białek zdolnych do odwracalnego przełączania fałd.

Fs-KaiB ma fałd podobny do tioredoksyny, który bardzo przypomina N-koniec SasA i konkurencyjnie wypiera wiązanie kinazy z KaiC. Jednak zmiana konformacji z gs-KaiB na fs-KaiB zachodzi powoli, umożliwiając wiązanie SasA z KaiC i dalszą aktywację RpaA od południa – kiedy pętla B zostaje po raz pierwszy odsłonięta – do zmierzchu. W rezultacie fosfo-RpaA gromadzi się w miarę upływu dnia i osiąga szczyt w pobliżu zmierzchu, odpowiednio dostosowując czas do wzrostu ekspresji genów klasy 1. Co więcej, to opóźnienie w wiązaniu KaiB opóźnia początek aktywności autofosfatazy w KaiC, przyczyniając się do okołodobowego okresu oscylatora cyjanobakteryjnego.

Regulacja oscylatora Kai

Podczas gdy rytmikę w oscylatorze KaiABC można odtworzyć in vitro , zegar podlega różnym dodatkowym poziomom regulacji in vivo . Na przykład, aby zachować rytmiczność, należy zachować stosunek stechiometryczny składników zegara. kaiB i kaiC – których poziomy transkryptu i białka znacznie oscylują w ciągu dnia – stanowią operon pod kontrolą pojedynczego promotora i są transkrybowane jako policistronowy mRNA. Natomiast poziomy białka KaiA, które znajduje się pod kontrolą niezależnego promotora, pozostają na dość wysokim poziomie przez okres 24 godzin.

Ponadto faza oscylatora Kai może być przesuwana w odpowiedzi na zmiany środowiskowe. Jednak w przeciwieństwie do mechanizmów przesunięcia fazowego charakterystycznych dla organizmów eukariotycznych, wydaje się, że fotopigmenty nie odgrywają roli w porywaniu zegara cyjanobakterii. Zamiast tego zidentyfikowane mechanizmy wejściowe opierają się na zmianach biochemicznych, które śledzą reakcje fotosyntezy przeprowadzane przez cyjanobakterie, reakcje, których tempo wzrasta proporcjonalnie do natężenia światła otoczenia. Na przykład CikA i LdpA wyczuwają stan redoks środowiska wewnątrzkomórkowego i przekazują zmiany do oscylatora Kai. Ponadto wydaje się, że KaiA i KaiC bezpośrednio wykrywają metabolity fotosyntezy – w szczególności chinon i ATP – i odpowiednio dostosuj fazę oscylatora. Do tej pory KaiB nie był zaangażowany w ścieżkę wejściową zdolną do porywania zegara cyjanobakteryjnego.

Obecne badania

Zarówno laboratorium dr Carla Johnsona na Vanderbilt University, jak i laboratorium dr Michaela Rusta na University of Chicago prowadzą badania skupione na kompleksie KaiABC. Laboratorium Johnsona, we współpracy z laboratorium dr Hassane'a Mchaouraba, skupia się na wykorzystaniu metod biofizycznych do wyjaśnienia, w jaki sposób zegar cyjanobakterii oscyluje in vitro . Ponadto mają nadzieję odkryć adaptacyjne znaczenie rytmów okołodobowych przy użyciu mutantów genu zegara cyjanobakterii. Laboratorium Rust bada, w jaki sposób interakcje białek, neuroprzekaźników i gradientów jonów wpływają na zachowanie żywych komórek cyjanobakterii, wykorzystując kombinację technik, takich jak zaawansowana biochemiczna mikroskopia i modelowanie matematyczne.