Mikromacierz przeciwciał

Próbki tworzonych i wykrywanych mikromacierzy przeciwciał.

Mikromacierz przeciwciał (znana również jako macierz przeciwciał ) jest specyficzną formą mikromacierzy białkowej . W tej technologii zbiór wychwyconych przeciwciał jest nakrapiany i utrwalany na stałej powierzchni, takiej jak szkło, plastik, membrana lub chip silikonowy, i wykrywana jest interakcja między przeciwciałem a jego docelowym antygenem. Mikromacierze przeciwciał są często używane do wykrywania ekspresji białek z różnych biopłynów, w tym surowicy, osocza i lizatów komórkowych lub tkankowych. Macierze przeciwciał mogą być wykorzystywane zarówno do badań podstawowych, jak i do zastosowań medycznych i diagnostycznych.

Tło

Koncepcja i metodologia mikromacierzy przeciwciał zostały po raz pierwszy wprowadzone przez Tse Wen Chang w 1983 roku w publikacji naukowej i serii patentów, kiedy pracował w Centocor w Malvern w Pensylwanii . Chang ukuł termin „matryca przeciwciał” i omówił układ „tablicy” maleńkich plamek przeciwciał na małych szklanych lub plastikowych powierzchniach. Wykazał, że siatkę plamek przeciwciał 10×10 (łącznie 100) i 20×20 (łącznie 400) można umieścić na powierzchni 1×1 cm. Ocenił również, że jeśli przeciwciało zostanie pokryte w stężeniu 10 μg/ml, które jest optymalne dla większości przeciwciał, 1 mg przeciwciała może utworzyć 2 000 000 kropek o średnicy 0,25 mm. Wynalazek Changa koncentrował się na zastosowaniu mikromacierzy przeciwciał do wykrywania i oznaczania ilościowego komórek zawierających pewne antygeny powierzchniowe, takie jak antygeny CD i antygeny HLA , antygeny cząstek stałych, takie jak wirusy i bakterie, oraz antygeny rozpuszczalne. Zasada „nakładanie jednej próbki, wiele oznaczeń”, konfiguracja testu i mechanika umieszczania kropek absorpcyjnych opisana w artykule i patentach powinna mieć ogólne zastosowanie do różnych rodzajów mikromacierzy . Kiedy Tse Wen Chang i Nancy T. Chang zakładały Tanox , Inc. w Houston w Teksasie w 1986 roku, zakupiły prawa do patentów na matrycę przeciwciał od Centocor jako część bazy technologicznej do budowy nowego start-upu. Ich pierwszym opracowywanym produktem był ^{test zwany} „ cytometrią immunosorpcyjną” ^, który można ^{wykorzystać do} monitorowania statusu immunologicznego , tj . zainfekowane osobniki.

Teoretyczne podstawy testów wiązania ligandów opartych na mikromacierzach białkowych zostały dalej rozwinięte przez Rogera Ekinsa i współpracowników pod koniec lat 80. Zgodnie z modelem mikromacierze przeciwciał nie tylko umożliwiłyby równoczesne badanie przesiewowe panelu analitów, ale byłyby również bardziej czułe i szybsze niż konwencjonalne metody przesiewowe. Zainteresowanie badaniami przesiewowymi dużych zestawów białek pojawiło się dopiero w wyniku osiągnięć w genomice mikromacierzy DNA i Human Genome Project .

Pierwsze podejście do macierzy miało na celu miniaturyzację testów biochemicznych i immunobiologicznych, zwykle przeprowadzanych na 96-dołkowych płytkach do mikromiareczkowania. Podczas gdy macierze przeciwciał oparte na 96-dołkowych płytkach mają wysoką przepustowość, mała powierzchnia w każdym dołku ogranicza liczbę plamek przeciwciał, a tym samym liczbę wykrywanych analitów. Następnie wykorzystano inne podłoża stałe, takie jak szkiełka mikroskopowe i membrany nitrocelulozowe, aby opracować macierze, które mogłyby pomieścić większe panele przeciwciał. Macierze oparte na membranie nitrocelulozowej są elastyczne, łatwe w obsłudze i mają zwiększoną zdolność wiązania białek, ale są mniej podatne na wysoką przepustowość lub zautomatyzowane przetwarzanie. Chemicznie derywatyzowane szkiełka umożliwiają drukowanie plamek przeciwciał o wielkości poniżej mikrolitra, zmniejszając powierzchnię macierzy bez utraty gęstości plamki. To z kolei zmniejsza objętość zużywanej próbki. Szklane matryce, dzięki swojej gładkiej i sztywnej strukturze, mogą być również łatwo montowane w systemach transportu cieczy o dużej przepustowości.

Większość systemów macierzy przeciwciał wykorzystuje 1 z 2 niekonkurencyjnych metod immunodetekcji: wykrywanie pojedynczego przeciwciała (oparte na znacznikach) i wykrywanie 2 przeciwciał (oparte na kanapce). Ta ostatnia metoda, w której wykrywanie analitu wymaga związania 2 różnych przeciwciał (przeciwciała wychwytującego i przeciwciała reporterowego, z których każde wiąże się z unikalnym epitopem), zapewnia większą specyficzność i niższy sygnał tła w porównaniu z immunodetekcją opartą na znacznikach (gdzie tylko 1 wychwyt stosuje się przeciwciało, a wykrywanie uzyskuje się poprzez chemiczne znakowanie wszystkich białek w próbce wyjściowej). Macierze przeciwciał oparte na kanapkach zwykle osiągają najwyższą specyficzność i czułość (poziomy ng – pg) spośród wszystkich formatów macierzy; ich powtarzalność umożliwia również przeprowadzenie analizy ilościowej. Ze względu na trudność w opracowaniu dopasowanych par przeciwciał, które są kompatybilne ze wszystkimi innymi przeciwciałami w panelu, małe macierze często wykorzystują podejście kanapkowe. I odwrotnie, macierze o dużej gęstości są łatwiejsze do opracowania przy niższych kosztach przy użyciu podejścia opartego na pojedynczym etykiecie przeciwciała. W tej metodologii używany jest jeden zestaw swoistych przeciwciał, a wszystkie białka w próbce są znakowane bezpośrednio barwnikami fluorescencyjnymi lub haptenami.

Początkowe zastosowania systemów macierzowych opartych na przeciwciałach obejmowały wykrywanie IgG i określonych podklas, analizę antygenów, skrining rekombinowanych przeciwciał , badanie kinaz białkowych drożdży, analizę przeciwciał autoimmunologicznych i badanie interakcji białko-białko. Pierwszym podejściem do jednoczesnego wykrywania wielu cytokin z próbek fizjologicznych przy użyciu technologii macierzy przeciwciał był Ruo-Pan Huang i współpracownicy w 2001 r. W ich podejściu wykorzystano membrany Hybond ECL do wykrycia małego panelu 24 cytokin z kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych i surowic pacjentów i było w stanie profilować ekspresję cytokin na poziomach fizjologicznych. Huang wykorzystał tę technologię i założył nową firmę, RayBiotech, Inc., pierwszą, która z powodzeniem skomercjalizowała planarną macierz przeciwciał.

W ciągu ostatnich dziesięciu lat poprawiono czułość metody poprzez optymalizację chemii powierzchni oraz dedykowane protokoły ich chemicznego znakowania. Obecnie czułość macierzy przeciwciał jest porównywalna z czułością testu ELISA, a macierze przeciwciał są regularnie wykorzystywane do profilowania eksperymentów na próbkach tkanek, próbkach osocza lub surowicy oraz wielu innych rodzajach próbek. Jednym z głównych celów badań profilowania opartych na macierzach przeciwciał jest odkrywanie biomarkerów, szczególnie w przypadku raka. Na potrzeby badań nad rakiem w 2010 r. zgłoszono opracowanie i zastosowanie macierzy przeciwciał zawierającej 810 różnych przeciwciał związanych z rakiem. Również w 2010 r. opracowano macierz przeciwciał zawierającą 507 cytokin, chemokin, adipokin, czynników wzrostu, czynników angiogennych, proteaz, rozpuszczalnych receptory, rozpuszczalne cząsteczki adhezyjne i inne białka zastosowano do badania przesiewowego surowicy pacjentek z rakiem jajnika i osób zdrowych i stwierdzono znaczącą różnicę w ekspresji białek między próbkami normalnymi i nowotworowymi. Niedawno tablice przeciwciał pomogły określić specyficzne białka surowicy związane z alergią, których poziomy są związane z glejakiem i mogą zmniejszyć ryzyko na wiele lat przed diagnozą. Profilowanie białek za pomocą macierzy przeciwciał okazało się również skuteczne w obszarach innych niż badania nad rakiem, w szczególności w chorobach neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera. W wielu badaniach próbowano zidentyfikować panele biomarkerów, które mogą rozróżnić pacjentów z chorobą Alzheimera, a wiele z nich wykorzystywało w tym procesie macierze przeciwciał. Jaeger i współpracownicy zmierzyli prawie 600 białek krążeniowych, aby odkryć ścieżki biologiczne i sieci dotknięte chorobą Alzheimera i zbadali pozytywne i negatywne związki poziomów tych poszczególnych białek i sieci z wydajnością poznawczą pacjentów z chorobą Alzheimera. Obecnie największa dostępna komercyjnie macierz przeciwciał oparta na kanapkach wykrywa 1000 różnych białek. , które równolegle analizują obfitość białek i status fosforylacji lub ubikwitynylacji 1030 białek.

Macierze przeciwciał są często wykorzystywane do wykrywania ekspresji białek z wielu typów próbek, ale także z różnych preparatów. Jiang i współpracownicy ładnie zilustrowali korelację między ekspresją białka macierzowego w dwóch różnych preparatach krwi: surowicy i wysuszonych plamach krwi. Te różne preparaty próbek krwi analizowano przy użyciu trzech platform macierzy przeciwciał: opartej na kanapkach, ilościowej i opartej na etykietach, i stwierdzono silną korelację w ekspresji białka, co sugeruje, że wysuszone plamki krwi, które są wygodniejsze, bezpieczniejsze i tańsze sposoby pozyskiwania krwi, zwłaszcza w niehospitalizowanych obszarach zdrowia publicznego, mogą być skutecznie stosowane wraz z analizą macierzy przeciwciał w celu odkrywania biomarkerów, profilowania białek oraz badań przesiewowych, diagnozowania i leczenia chorób.

Aplikacje

Wykorzystanie mikromacierzy przeciwciał w różnych obszarach diagnostyki medycznej przyciągnęło uwagę badaczy. Cyfrowy test biologiczny jest przykładem takich dziedzin badawczych. W tej technologii szereg mikrodołków na szklanym/polimerowym chipie zaszczepia się kulkami magnetycznymi (pokrytymi przeciwciałami ze znacznikami fluorescencyjnymi), poddaje działaniu ukierunkowanych antygenów, a następnie charakteryzuje pod mikroskopem poprzez zliczanie fluoryzujących dołków. Niedawno zademonstrowano opłacalną platformę wytwarzania (przy użyciu polimerów OSTE ) dla takich macierzy mikrodołków, a modelowy system testów biologicznych został pomyślnie scharakteryzowany. Ponadto wykazano, że testy immunologiczne na rusztowaniach mikropillarowych tiol-enu „papier syntetyczny” generują lepszy sygnał fluorescencyjny.

Zobacz też