Mikroprzepływowe haplotypowanie całego genomu

Mikroprzepływowe haplotypowanie całego genomu to technika fizycznego oddzielania poszczególnych chromosomów od komórki metafazowej, po której następuje bezpośrednie rozdzielanie haplotypu dla każdego allelu.

Tło

Haplotypowanie całego genomu

Haplotypowanie całego genomu to proces rozwiązywania osobistych haplotypów na podstawie całego genomu . Obecne metody sekwencjonowania nowej generacji są w stanie zidentyfikować heterozygotyczne loci, ale nie są dobrze przystosowane do identyfikacji polimorfizmów występujących w tej samej (w cis) lub allelicznej (w trans) nici DNA. Informacje o haplotypie przyczyniają się do zrozumienia potencjalnych skutków funkcjonalnych wariantów cis lub trans. Haplotypy są częściej rozpoznawane przez wnioskowanie poprzez porównanie z genotypami rodzicielskimi lub z próbek populacji przy użyciu statystycznych metod obliczeniowych w celu określenia nierównowagi sprzężeń między markerami. Bezpośrednie haplotypowanie jest możliwe poprzez izolację chromosomy lub segmenty chromosomów. Większość biologii molekularnej może dokładnie określić haplotypy tylko ograniczonego regionu genomu. Haplotypowanie bezpośrednie całego genomu obejmuje rozdzielenie haplotypu na poziomie całego genomu, zwykle poprzez izolację pojedynczych chromosomów.

Haplotyp

Haplotyp ( haplo : od starogreckiego ἁπλόος (haplóos, „pojedynczy, prosty”) to ciągła sekcja ściśle powiązanych segmentów DNA w obrębie większego genomu , które zwykle są dziedziczone razem jako jednostka na pojedynczym chromosomie . Haplotypy nie mają zdefiniowanego rozmiar i może odnosić się do wszystkiego, od kilku ściśle powiązanych loci do całego chromosomu.Termin ten jest również używany do opisania grup polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP), które są statystycznie powiązane. Większość wiedzy na temat asocjacji SNP pochodzi z Międzynarodowego Projektu HapMap , który okazał się potężnym zasobem w rozwoju publicznie dostępnej bazy danych zmienności genetycznej człowieka.

Fazowanie

Fazowanie to proces identyfikacji indywidualnego dopełnienia homologicznych chromosomów . Metody fazowania obejmują między innymi analizę rodowodową, allelowo-specyficzny PCR , analizę haplotypów PCR w emulsji sprzęgającej, PCR polonów , typowanie plemników, klonowanie sztucznych chromosomów bakteryjnych , konstrukcję hybryd komórek somatycznych, mikroskopię sił atomowych. Fazowanie haplotypów można również osiągnąć za pomocą metod wnioskowania obliczeniowego.

Mikrofluidyka

Mikrofluidyka odnosi się do wykorzystania mikrokanałów w systemie mikroelektromechanicznym ( MEMS ). Kanały mikroprzepływowe mają średnicę 10-100 μm, co umożliwia manipulację i analizę niewielkich objętości. Technologia ta łączy inżynierię, fizykę, chemię, biologię i optykę. W ciągu ostatnich dziesięcioleci zrewolucjonizował biologię, genetykę i proteomikę w skali mikro i nanoskali. Urządzenia mikroprzepływowe mogą łączyć kilka etapów analitycznych w jednym urządzeniu. Ta technologia została wymyślona przez niektórych jako technologia „laboratorium na chipie”. Większość obecnych metod biologii molekularnej wykorzystuje jakąś formę MEMS, w tym mikromacierzy technologie i instrumenty do sekwencjonowania nowej generacji .

Mikroprzepływowe bezpośrednie deterministyczne fazowanie

Zasada

Bezpośrednie deterministyczne fazowanie poszczególnych chromosomów można osiągnąć, izolując pojedyncze chromosomy do analizy genetycznej za pomocą urządzenia mikroprzepływowego .

Metody

Microfluidic chromosome separation and amplification.
Przebieg pracy izolacji i amplifikacji chromosomów mikroprzepływowych całego genomu. Nie w skali

Pojedyncza komórka metafazowa jest izolowana z roztworu. Chromosomy są następnie uwalniane z jądra, a cytoplazma jest trawiona enzymatycznie. Następnie zawiesina chromosomów jest kierowana w kierunku wielu kanałów podziału. Chromosomy są fizycznie kierowane do kanałów podziału za pomocą szeregu zaworów. W pierwszym opisie tej techniki Fan i in. zaprojektował autorski program (MatLab) do sterowania tym procesem. Po rozdzieleniu chromosomy przygotowuje się do amplifikacji przez sekwencyjne dodawanie i wypłukiwanie trypsyny, buforu denaturującego i roztworu neutralizującego. DNA jest wtedy gotowe do dalszego przetwarzania. Ze względu na niewielką ilość DNA, amplifikację należy przeprowadzić przy użyciu zestawów wyspecjalizowanych do bardzo małych początkowych ilości DNA. Zamplifikowany DNA wypłukuje się z urządzenia mikroprzepływowego i rozpuszcza przez dodanie buforu. Amplifikowany DNA można teraz analizować różnymi metodami.

Po wyizolowaniu i amplifikacji chromosomów można zastosować dowolne haplotypowanie molekularne, o ile chromosomy pozostają odrębne. Można to osiągnąć, utrzymując je fizycznie oddzielone lub identyfikując każdą próbkę za pomocą genotypowania. Po zidentyfikowaniu każdego chromosomu każdą parę homologów można przyporządkować do jednego z dwóch haploidalnych genomów.

Aplikacje

Mikroprzepływowe bezpośrednie deterministyczne fazowanie umożliwia wyizolowanie wszystkich chromosomów w tym samym eksperymencie. Ta unikalna cecha sugeruje możliwe zastosowania w dziedzinie klinicznej, badawczej i genomiki osobistej. Niektóre z możliwych zastosowań klinicznych tej techniki obejmują fazowanie wielu mutacji, gdy próbki rodzicielskie są niedostępne, preimplantacyjna diagnostyka genetyczna , diagnostyka prenatalna oraz charakteryzacja komórek nowotworowych.

Haplotypowanie całego genomu za pomocą mikroprzepływów zwiększy tempo odkrywania w ramach projektu HapMap i zapewni możliwość potwierdzenia i wykrycia błędów w istniejącej bazie danych. Dostarczy to dalszych informacji w genetycznych badaniach asocjacyjnych.

W miarę ulepszania metod amplifikacji niewielkich ilości DNA możliwe jest sekwencjonowanie pojedynczego chromosomu przy użyciu mikroprzepływów w celu oddzielenia każdego pojedynczego chromosomu. Opłacalnym podejściem może być kod kreskowy każdego pojedynczego chromosomu i równoległe ponowne sekwencjonowanie całego indywidualnego genomu. Amplifikacja każdego chromosomu z osobna zapewnia również mechanizm potencjalnego wypełnienia niektórych luk, które pozostają w ludzkim genomie referencyjnym . Sekwencjonowanie pojedynczego chromosomu pozwoli na powiązanie niezmapowanych sekwencji z pojedynczym chromosomem. Ponadto sekwencjonowanie pojedynczego chromosomu będzie dokładniejsze w identyfikacji wariantów liczby kopii i powtarzalnych sekwencji.

Ograniczenia

Od stycznia 2011 tylko jedna publikacja opisała zastosowanie tej techniki. Wspólne zasoby naukowe czekają na dalszą walidację tej metody i jej skuteczności w izolowaniu i amplifikacji dających się analizować ilości DNA. Chociaż ta metoda usprawnia proces izolacji chromosomów, niektóre części tego procesu – takie jak początkowa izolacja komórki metafazowej – pozostają trudne i pracochłonne. Inne zautomatyzowane techniki separacji komórek metafazowych poprawiłyby przepustowość. Ponadto ta metoda ma zastosowanie tylko do komórek w metafazie, co z natury ogranicza tę technikę do typów komórek i tkanek, które przechodzą mitozę . Analiza pojedynczej komórki nie uwzględnia możliwości mozaicyzmu ; dlatego zastosowania w diagnostyce raka i badaniach musiałyby koniecznie wymagać przetwarzania wielu komórek. Wreszcie, ponieważ cały ten proces opiera się na amplifikacji z pojedynczej komórki, dokładność jakiejkolwiek analizy genetycznej jest ograniczona do zdolności dostępnych na rynku platform do wytworzenia wystarczającej ilości obiektywnego i wolnego od błędów amplikonu.

Alternatywne metody haplotypowania całego genomu

Mikrodysekcja chromosomów

Mikrodysekcja chromosomów to kolejny proces izolowania pojedynczych chromosomów do analizy genetycznej. Podobnie jak w przypadku powyższej techniki mikrodysekcja zaczyna się od komórek metafazowych. Jądro jest poddawane mechanicznej lizie na szklanym szkiełku, a część materiału genetycznego jest rozdzielana pod mikroskopem. Właściwa mikrodysekcja materiału genetycznego została początkowo osiągnięta poprzez ostrożne użycie cienkiej igły. Obecnie dostępne są lasery sterowane komputerowo. Wyizolowany obszar genomowy może obejmować część pojedynczego chromosomu, aż do kilku chromosomów. Aby przeprowadzić haplotypowanie całego genomu, skrawek genomu poddany mikropreparacji jest amplifikowany i genotypowany lub sekwencjonowany. Podobnie jak w przypadku techniki mikroprzepływowej, do rozwiązania problemu małej początkowej próbki DNA niezbędne są wyspecjalizowane platformy do amplifikacji.

Klonowanie dużej wkładki

Losowe podzielenie kompletnej diploidalnej biblioteki kosmidów na różne pule o równej wielkości stanowi alternatywną metodę fazowania haplotypów. W dowodowym opisie tej techniki utworzono 115 puli zawierających ~5000 unikalnych klonów z oryginalnej biblioteki kosmidów. Każda z tych pul zawierała około 3% genomu. Pomiędzy 3% w każdej puli i faktem, że każdy klon jest losową próbką diploidalnego genomu, 99,1% czasu każda pula zawiera DNA z jednego homologu. Amplifikacja i analiza każdej puli zapewnia rozdzielczość haplotypów ograniczoną jedynie rozmiarem wstawki kosmidowej.

  1. ^ Następna faza genetyki człowieka. Bansal V. i in. Nat Biotechnologia. Styczeń 2011;29(1):38-9.
  2. ^   Łączenie analizy haplotypów PCR w emulsji. Wetmur JG, Chen J. Metody Mol Biol. 2011;687:165-75. PMID 20967607
  3. ^ Haplotypowanie polonów dalekiego zasięgu poszczególnych cząsteczek ludzkiego chromosomu. Zhang K. i in. Nat. Genet. 2006;38:382–87
  4. ^ mikroprzepływy do zastosowań biologicznych. Finehout E, Tian WC. Springera USA. 2009.
  5. ^ a b Haplotypowanie molekularne pojedynczych komórek całego genomu. Fan HC i in. Nat Biotechnologia. 2011
  6. ^ Amplifikacja całego genomu z mikrodysekcji chromosomów. M. Hockner i in. Badania cytogenetyczne i genomowe 2009; 125: 98-102
  7. ^ Bezpośrednie określenie haplotypów molekularnych przez mikrodysekcję chromosomów. L. Ma i in. Metody natury, tom. 7 nie. 4 299-301.
  8. ^ Segmentacja specyficzna dla chromosomu ujawniona przez analizę strukturalną indywidualnie izolowanych chromosomów. K. Kitada i in. Geny, chromosomy i rak, 50(4): 217–227, kwiecień 2011
  9. ^ Rozwiązane na podstawie haplotypów sekwencjonowanie genomu osoby z Indii Gudżarati. JO Kitzman i in. Nature Biotechnology tom 29 nr 1 59-63

Linki zewnętrzne

Pobrane z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Microfluidic_whole_genome_haplotyping&oldid=1123483063 ”