Mutageneza kasetowa
Mutageneza kasetowa to rodzaj ukierunkowanej mutagenezy , w której wykorzystuje się krótką, dwuniciową sekwencję oligonukleotydową ( kasetę genową ) w celu zastąpienia fragmentu docelowego DNA . Wykorzystuje komplementarne końce trawione enzymami restrykcyjnymi na docelowym DNA i kasecie genowej, aby osiągnąć specyficzność. Różni się od metod wykorzystujących pojedynczy oligonukleotyd tym, że pojedyncza kaseta genowa może zawierać wiele mutacji. W przeciwieństwie do wielu metod mutagenezy ukierunkowanej, mutageneza kasetowa również nie obejmuje wydłużania startera przez polimerazę DNA .
Mechanizm
Najpierw stosuje się enzymy restrykcyjne do cięcia w pobliżu docelowej sekwencji DNA zawartego w odpowiednim wektorze . Ten krok usuwa sekwencję docelową i wszystko pomiędzy miejscami restrykcyjnymi. Następnie syntetyczny dwuniciowy DNA zawierający pożądaną mutację i końce , które są komplementarne do końców trawionych restrykcjami, poddaje się ligacji w miejsce usuniętej sekwencji. Na koniec powstały konstrukt jest sekwencjonowany w celu sprawdzenia, czy sekwencja docelowa zawiera zamierzoną mutację.
Stosowanie
Zastosowanie syntetycznej kasety genowej pozwala na całkowitą kontrolę nad rodzajem mutacji, którą można wygenerować. Podczas badania funkcji białek mutageneza kasetowa może pozwolić naukowcowi na zmianę poszczególnych aminokwasów poprzez wprowadzenie różnych kodonów lub pominięcie kodonów.
Włączając sekwencję SD i kilka pierwszych kodonów genu, naukowiec może łatwo i radykalnie wpłynąć na poziom ekspresji białka poprzez zmianę tych sekwencji regulatorowych .
Ograniczenia
Aby zastosować tę metodę, musi być znana sekwencja sekwencji docelowej i pobliskie miejsca restrykcyjne. Ponieważ enzymy restrykcyjne , aby ta metoda była użyteczna, miejsca restrykcyjne flankujące docelowy DNA muszą być unikalne w układzie gen / wektor , tak aby kaseta genowa mogła zostać wstawiona ze specyficznością. Długość sekwencji otoczonej miejscami restrykcyjnymi jest również czynnikiem ograniczającym ze względu na zastosowanie syntetycznych kaset genowych.
Zalety
Ponieważ jedna kaseta genowa może zawierać wiele mutacji, potrzebna jest mniejsza całkowita synteza i oczyszczanie oligonukleotydów. W porównaniu z metodami mutagenezy, które wymagają syntezy dwuniciowego DNA przy użyciu jednoniciowej matrycy (1-30% in vitro w M13 ), skuteczność ligacji kasety oligodeoksynukleotydowej jest bliska 100%. Wysoka wydajność mutagenezy oznacza, że mutanty można przeszukiwać bezpośrednio przez sekwencjonowanie. Po ustawieniu wektora z flankującymi miejscami restrykcyjnymi, wszystkie manipulacje (tj. mutageneza , sekwencjonowanie , ekspresja ) można przeprowadzić na tym samym plazmidzie .